Роль актин-связывающего белка кортактина в регуляции эпителиальных натриевых каналов (ENaC)

• Автор: Илатовская, Дарья Викторовна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 110 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
1 ВВЕДЕНИЕ

1.1 Актуальность исследования

1.2 Цели и задачи исследования

1.3 Основные положения, выносимые на защиту

1.4 Научная новизна

1.5 Теоретическое и практическое значение работы

1.6 Апробация работы

1.7 Публикации и личный вклад автора

1.8 Объем и структура диссертации

1.9 Финансовая поддержка
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1 Транспорт натрия в собирательных трубочках почки
2.1.1 Общая структура нефрона. Собирательные трубочки почки
2.1.2 Транспорт натрия в собирательных трубочках почки
2.2 Эпителиальные натриевые каналы: молекулярная организация,
биофизические характеристики и физиологическая роль
2.2.1 Суперсемейство дегенерины/эпителиальные натриевые каналы
2.2.2 Физиологическая значимость ЕІМаС и болезни, опосредованные патологиями в структуре/регуляции канала
2.2.3 Молекулярная организация эпителиальных натриевых каналов
2.2.4 Стехиометрия эпителиальных натриевых каналов
2.2.5 Биофизические характеристики эпителиальных натриевых каналов: селективность, кинетика, фармакология, взаимодействие с блокирующими агентами
2.3 Некоторые механизмы регуляции эпителиальных натриевых каналов
2.3.1 Альдостерон-зависимая регуляция эпителиальных натриевых каналов
2.3.2 Модуляция активности эпителиальных натриевых каналов посредством убиквитинирования и деубиквитинирования
2.3.3 Роль протеолитического расщепления в регуляции эпителиальных натриевых каналов
2.3.4 Механочувствительность эпителиальных натриевых каналов
2.4 Регуляция натриевых каналов посредством актинового цитоскелета
2.4.1 Роль кортикального актина в регуляции натриевых каналов в клетках миелоидной лейкемии К562
2.4.2 Роль актинового цитоскелета в регуляции эпителиальных натриевых каналов
2.5 Актин-связывающий белок кортактин и комплекс Агр2/3
2.5.1 Участие кортактина в регуляции ионных каналов
2.5.2 Белковый комплекс Агр2/3 и его химические ингибиторы
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1 Клеточные культуры
3.2 Реагенты и антитела
3.2.1 Антитела
3.2.2 Реагенты и плазмиды
3.3 Выделение собирательных трубочек почки крысы
3.4 Электрофизиологические методы
3.4.1 Метод патч-кламп
3.4.2 Измерение трансэпителиального потенциала
3.4.3 Растворы, использованные в электрофизиологических
экспериментах
3.5 Молекулярно-биохимические методы
3.5.1 Измерение цитотоксичности
3.5.2 Выделение белков
3.5.3 Коиммунопреципитация
3.5.4 Выделение белков плазматической мембраны
3.5.5 Электрофорез и иммуноблотинг
3.5.6 Иммуногистохимическое окрашивание ткани почки крысы
3.5.7 Окрашивание актинового цитоскелета
3.6 Работа с бактериями, временная и постоянная трансфекции
3.6.1 Приготовление компетентных бактериальных клеток
3.6.2 Трансформация бактерий, выделение и очистка плазмид
3.6.3 Временная трансфекция монослойной культуры
3.6.4 Создание постоянных клеточных линий с пониженной экспрессией
целевого белка методом лентивирусной трансфекции
3.7 Микроскопия
3.7.1 Флуоресцентная микроскопия фиксированных препаратов и
обработка изображений
3.7.2 Электронная микроскопия
3.7.3 Статистические расчеты
РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1 Исследование роли разборки Г-актина в регуляции эпителиальных натриевых каналов
4.1.1 Влияние разрушения актинового цитоскелета на активность
эпителиальных натриевых каналов, экспрессированных в клетках СНО и НЕК293-Т
4.1.2 Активация эндогенных эпителиальных натриевых каналов в
клетках собирательных трубочек почки в ответ на разрушение актиновых микрофиламентов
4.1.3 Изучение изменения доли эпителиальных натриевых каналов в мембране при разборке актинового цитоскелета
4.2 Определение влияния актин-связывающего белка кортактина на активность эпителиальных натриевых каналов

предобработка колхицином (реагент, разрушающий микротрубочки) или цит Д в течение 1-2 часов устраняла этот эффект. Из полученных данных был сделан вывод о том, что полимеризованный цитоскелет необходим для опосредованного малыми ГТФазами увеличения активности Е№С.
Известно, что ЕИаС является механочувствительным каналом, активность которого увеличивается под воздействием протока жидкости (Вачугова, Морачевская, 2009). В связи с этим нашей лабораторией была исследована роль актинового цитоскелета и малых ГТФаз в механозависимой активации канала. (Кагршйеу й а1., 2010). Предобработка цитД и латрункулином Б в течение 20 мин или 1-2 часов с целью разборки актинового цитоскелета не оказала влияния на проток-зависимую активацию ЕЫаС. Более того, совместная экспрессия субъединиц шЕИаС и постоянно активного (ОИУ) или доминантно негативного (Т19И) мутантов малой ГТФазы ШюА также не вызвала изменений в величине проток-активированного амилорид-чувствительного тока. Таким образом, было установлено, что проток-зависимая активация ЕЫаС не связана с модификациями актинового цитоскелета и малыми О-белками
В рамках темы регуляции ЕИаС цитоскелет-связывающими белками и малыми ГТФазами была поставлена задача изучить вовлечение контролирующих сборку актинового цитоскелета белков семейства И-АУАБРЛАУЕ в модуляцию активности ЕЫаС. Показано, что малая ГТФаза Кас I и комплекс \0АУЕ1/2 являются частью одного сигнального пути, ведущего к повышению активности ЕКаС (Кагршйеу й а1., 2011).
На сегодняшний день детальный механизм, посредством которого микрофиламенты регулируют активность ЕИаС, неизвестен. Результаты многих экспериментов свидетельствуют о том, что стимулирующим действием на ЕИаС обладают короткие актиновые филаменты, а не мономерный О или фибриллярный Е-актин. Предполагается, что динамические изменения в организации микрофиламентов (например, разборка Б-актина с образованием коротких актиновых филаментов) является одним из возможных механизмов модуляции актином активности Е№С. Опосредованное влияние актиновых филаментов на ЕИаС может также осуществляться путем регуляции микрофиламентами активности многих сигнальных молекул в клетке (Росйупуик й а1., 2007).