Изучение факторов, влияющих на секрецию и биологическую активность химерного белка "Альбумин-интерферон-альфа16", синтезируемого дрожжами Pichia pastoris

• Автор: Карабельский, Александр Владимирович
• Шифр специальности: 03.03.04, 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 198 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1. РЕКОМБИНАНТНЫЕ а-ИНТЕРФЕРОНЫ ЧЕЛОВЕКА: ПРОДУКЦИЯ И
ПУТИ УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ (обзор литературы)
1Л Классификация интерферонов
1.2 Интерферон-альфа
1.2.1 Рецептор интерферона-альфа и сигнальная трансдукция
.1.2.2 Молекулярный механизм действия интерферона
1.2.3 Биологическая активность интерферона-альфа и его место в иммунном ответе
1.2.4 Клиническое применение
1.3 Интерфероны-альфа пролонгированного действия
1.3.1 Пегилирование
1.3.1.1 Физико-химические свойства ПЭГ и пегилированных белков
1.3.1.2 Фармакокинетические и фармакодинамические свойства ПЭГ-модифицировапных пептидов
1.3.1.3 Достоинства и недостатки ПЭГ-модифицированных пептидов
1.3.2 Липидизирование
1.3.3 Химерный белок “Альбумин-ИФН-а”
1.4 Создание продуцентов гетерологичных белков на основе микроорганизмов
1.4.1 Экспрессия гетерологичных эукариотических генов в дрожжах
1.4.2 Производство гетерологичных белков в метилотрофных дрожжах Р. ра$1оп$
1.5 Секреция рекомбинантных белков в дрожжах Р
1.5.1 Процессинг синальной последовательности
1.5.2 Гликозилирование
1.5.3 Фолдинг секреторных белков в ЭПР

1.5.3.1 Шапероны ЭПР
1.5.3.2 Формирование дисулъфидных связей и цис-транс-пептидилпролин изомеризация
1.5.3.3 Деградация неправильно сложенных белков
1.5.3.4 UPR - Реакция несвернутых белков
1.5.4 Внутриклеточные и экстраклеточные протеазы дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris
1.5.4.1 Сериновые протеазы
1.5.4.2 Аспарагиновые протеазы семейства япсинов
1.5.4.3 Способы снижения активности протеопитических ферментов в дрожжевых системах экспрессии
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Материалы
2.1.1 Штаммы
2.1.2 Условия культивирования штаммов
2.1.3 Плазмиды
2.2 Методы
2.2.1 Трансформация бактерий Е. coli
2.2.2 Трансформация дрожжей по методу PLATE
2.2.4 Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции
2.2.6 Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей
2.2.8 Полимеразная цепная реакция
2.2.9 Выделение хромосомной ДНК из дрожжей
2.2.10 Определение концентрации белка
2.2.11 Электрофорез белков в ПААГ в присутствии SDS
2.2.13 Выделение фракции микросом и белков клеточной оболочки из клеток дрожжей P. pastoris
2.2.14 Осаждение белков
2.2.15 Разделение белков в растворе. Гель-фильтрация
2.2.16 Разделение белков путем адсорбции. Хроматографические методы
2.2.17 Определение биологической активности Альбурона16
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1 Создание штамма дрожжей P. pastoris - продуцента химерного белка Альбурона16
3.1.1 Создание вектора экспрессии рР1С9Аьри
3.1.2 Получение трансформантов дрожжей P. pastoris, несущих химерный ген AbFN16
3.1.3 Анализ продукции гетерологичного химерного белка трансформантами P. pastoris
3.2 Изучение динамики синтеза и секреции химерного белка
3.3 Изучение влияния условий культивирования штамма GS115AbFN16 на уровень секреции Альбурона16
3.3.1 Влияние аэрации и способа культивирования на выход биомассы клеток и уровень синтеза белка
3.3.2 Влияние неорганического фосфата на продукцию химерного белка
3.3.3 Влияние температуры и времени культивирования на уровень продукции химерного белка
3.3.4 Анализ продуктов протеолиза Альбурона16
3.3.5 Анализ влияния pH, температуры, ЭДТА, ЭГТА, PMSF и состава культуральной среды на активность экстраклеточных протеаз дрожжей Р. pastoris
3.4 Выделение и очистка химерного белка Альбурона16
3.4.1 Очистка Альбурона16 из среды ВММ
3.4.2 Очистка Альбурона16 из среды ВММ2
4. ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ

1.4 Создание продуцентов гетерологичных белков на основе микроорганизмов
С открытием широкого спектра действия интерферонов и других биологически активных белков встала проблема их выделения, очистки и использования в качестве лекарственных препаратов. Интерфероны, как и другие иммуномодуляторы, вырабатываются в организме человека в малых дозах, поэтому невозможно получить значительные количества этих белков из донорской крови и культуры специализированных клеток.
С разработкой методов работы с ДНК in vitro появилась возможность клонировать различные гены и экспрессировать их в эукариотических и прокариотических клетках, и, таким образом, создавать промышленные штаммы-продуценты биологически-активных веществ. Большинство работ по созданию промышленных штаммов были выполнены на кишечной палочке E. coli. Были разработаны приемы генетического конструирования, изучены молекулярные механизмы экспрессии и регуляции активности различных генов в бактериях. В настоящее время на рынке существуют несколько препаратов рекомбинантного ИФН-а, полученного из E. coli:
ИФН-а2а - Реаферон® Вектор-фарм Россия; Роферон-А® Roche Швейцария; ИФН-а2Ь - Интрон-А® Schering-Plough, США; Реальдирон® Teva Pharm.Ind. Ltd. Израиль; Виферон® Ферон Россия; Интерфераль® ГосНИИ ОЧБ Россия; ИФН-а2с - Берофор® Boehringer Ingelheim Германия и др.
Технология рекомбинантных ДНК позволила производить лекарственные препараты с заданными свойствами (Muller et al., 2006). Фармакологическая биотехнология использует микро-, макроорганизмы и культуры клеток для создания новых лекарственных средств, повышения эффективности уже существующих лекарственных средств и для снижения стоимости производства