Механизмы повреждения и защита нейронов головного мозга при экспериментальном моделировании ишемии

• Автор: Стельмашук, Елена Викторовна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 280 с. : ил.

Содержание

Список сокращений

Глава 1. Введение

Глава 2. Обзор литературных данных

2.1. Экспериментальные подходы к моделированию ишемического повреждения нейронов головного мозга

2.1.1. Моделирование ишемии in vivo

2.1.2. Моделирование ишемии in vitro

2.2. Развитие ишемического повреждения нейронов головного мозга

2.2.1. Нейроцитотоксический эффект глутамата и роль митохондрий в его развитии

2.2.2. Депривация по глюкозе

2.2.3. Свободнорадикальное повреждение нейронов

2.2.4. Нарушение кислотно-щелочного равновесия
2.3. Роль глутамина в выживании и гибели нейронов
2.4. Фармакологическая защита нейронов от ишемического повреждения
2.5. Защита нейронов головного мозга от ишемического повреждения путем воздействия на эндогенные нейропротекторные системы
Глава 3. Материал и методы исследования
3.1. Объект исследования
3.2. Получение диссоциированных монослойных культур
3.3. Приготовление субстратов для культивирования
3.4. Схемы экспериментальных воздействий
3.4.1. Моделирование факторов ишемического повреждения нейронов in vitro
3.5. Приготовление препаратов для световой микроскопии
3.6. Методы количественного анализа культур и оценки выживаемости
3.7. Флуресцентная микроскопия
3.7.1. Определение внутриклеточных концентраций Са2+ и 1п1+
3.7.2. Определение мембранного потенциала митохондрий с помощью родамина
3.7.3. Определение активных форм кислорода гидроэтидином
3.8. Электронная микроскопия
3.9. Количественное определение мРНК к А81С1а методом ПЦР
3.10. Фотоиндуцированный тромбоз
3.11. Фокальная компрессионная ишемия
3.12. Измерение объема очага ишемического повреждения
3.13. Условный рефлекс пассивного избегания
Глава 4. Результаты исследования
4.1. Морфология культивированных зернистых нейронов мозжечка
4.2. Цитотоксическое действие глутамата
4.2.1. Сравнительный анализ цитотоксического действия глутамата на зернистые нейроны в различные сроки культивирования
4.3. Нейродеструктивное действие глюкозной депривации
4.3.1. Жизнеспособность нейронов при глюкозной депривации
4.3.2. Изменения внутриклеточной концентрации ионов Са2+ ([Са2+],) и
мембранного потенциала митохондрий при глюкозной депривации
4.3.3. Возрастание продукции активных форм кислорода в культивированных зернистых нейронах при глюкозной депривации
4.3.4. Влияние митохондриальных ингибиторов на [Ca2+]i и продукцию активных форм кислорода при глюкозной депривации
4.3.5. Влияние рутениевого красного и пиру вата на изменение мембранного потенциала митохондрий при глюкозной депривации
4.3.6. Зависимость действия глюкозной депривации от степени морфохимической дифференцировки культивированных зернистых нейронов in vitro. Обратимость эффекта глюкозной депривации
4.4. Окислительный стресс
4.4.1. Цитотоксическое действие параквата на нейрохимически зрелые и незрелые культивированные зернистые нейроны и значение глутамина для развития цитотоксичности
4.4.2. Антиоксидантный статус культивированных зернистых нейронов в различные сроки культивирования
4.4.3. Влияние предобработки уабаином зрелых и незрелых культивированных зернистых нейронов на окислительный стресс и нейрональный апоптоз
4.5. Ацидоз
4.5.1. Влияние ацидоза на жизнеспособность нейронов
4.5.2. Механизмы действия ацидоза на незрелые культивированные зернистые нейроны
4.5.3. Исследование механизма защитного действия менадиона
4.6. Особенности действия глутамина на культивированные зернистые нейроны
4.6.1 Влияние глутамина на мембранный потенциал митохондрий зрелых культивированных зернистых нейронов при глюкозной депривации
4.6.2. Влияние глутамина на жизнеспособность зрелых культивированных зернистых нейронов в норме и условиях глюкозной депривации
4.6.3. Влияние пирувата на жизнеспособность культивированных зернистых нейронов при глюкозной депривации
4.6.4. Влияние глутамина на жизнеспособность зрелых культивированных зернистых нейронов при химической гипоксии, индуцированной ротеноном
4.6.5. Влияние глутамина на выживаемость и [Са2+], незрелых культивированных зернистых нейронов при действии ротенона
4.6.6. Влияние глутамина на выживаемость и [Са2+], в незрелых культивированных зернистых нейронах при ингибированиии Ыа /К+-АТРазы уабаином

возрастает до 500-800 нмоль/мин, и это возрастание ингибируется специфическими блокаторами митохондриальной глутаминазы 6-диазо-5-кето-Ь-норлейцином и п-хлоромеркурифенилсульфоновой кислотой (Newcomb et al., 1997).
При нарушении кальциевого гомеостаза клеток митохондрии становятся источником избытка свободных радикалов в результате повышения утечки электронов с электрон-транспортной цепи на молекулярный кислород. На митохондриальных фракциях коры и мозжечка было показано, что при высоком уровне ионов Са2+ и Na+ в инкубационной среде генерация свободных радикалов в митохондриях повышается (Dykens, 1994). Впоследствии эти данные были подтверждены экспериментами, проведенными на клеточных культурах коры мозга мышей и крыс. Так, обработка культур NMDA индуцировала избыточную продукцию активных форм кислорода (АФК) в нейронах подобно митохондриальному разобщителю окислительного фосфорилирования 4-трифлуорометоксифенил гидразону (FCCP). Продукция АФК напрямую зависела от наличия внеклеточного Са2+ и снижалась ингибиторами цепи транспорта электронов в митохондриях (Lafon-Cazal et al., 1993, Dugan et al., 1995; Sengpiel et al., 1998; Castilho et al., 1999). Сам FCCP усиливал продукцию АФК, индуцированную NMDA (Sengpiel et al., 1998). В то же время доказано, что индукция неспецифической проницаемости митохондрий сопровождается усиленной генерацией АФК (Zorov et al., 2000; Batandier et al., 2004). Эти данные подтверждают гипотезу, согласно которой опосредованная гиперактивацией NMDA-рецепторов кальцийзависимая индукция неспецифической митохондриальной поры на фоне гиперстимуляции глутаматных рецепторов может способствовать развитию окислительного стресса нейронов. Однако данные Вергун и соавторами (Vergun et al., 2001) указывают на иной механизм участия свободных радикалов в глутаматной токсичности, основываясь на том, что комбинированная обработка нейронов гиппокампа