Грибы рода Pleurotus : генотипирование и анализ половой совместимости

• Автор: Шнырева, Анастасия Андреевна
• Шифр специальности: 03.02.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 129 с. : ил.

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Систематическое положение и характеристика видов рода Pleurotus

1.2 Концепция вида у грибов

1.3 Половое размножение высших базидиальных грибов и структура генов, участвующих в

процессе половой совместимости

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Объекты исследования

2.2 Культивирование штаммов вешенки

2.3 Получение плодовых тел в лабораторных условиях

2.3.1 Получение плодовых тел и споровых отпечатков на чашках Петри

2.3.2 Выгонка плодовых тел

2.4 Получение тестерных штаммов
2.5 Выделение ДНК, амплификация и анализ ITS последовательностей
2.5.1 Выделение геномной ДНК
2.5.2 Амплификация ITS последовательностей на матрице геномной ДНК
2.5.3 Секвенирование нуклеотидных последовательностей и анализ данных
2.5.4 Баркодинг на основе рестрикционного анализа ITS последовательностей
2.6 Биоинформатический анализ структуры matA локусов половой совместимости у представителей рода Pleurolus
2.7 Клонирование генов matA локуса
2.7.1 Вектор для клонирования и штаммы использованных микроорганизмов
2.7.2 Выделение ДНК
2.7.3 Приготовление компетентных клеток и трансформация
2.7.4 Амплификация и клонирование hclгенов гомеодоменных белков
Глава 3. Результаты н обсуждение
3.1 Культивирование видов рода Pleurotus в лабораторных условиях
3.2 Филогенетический анализ видов рода Pleurotus
3.2.1 Оценка «надежности» ITS последовательностей видов рода Pleurotus в ГенБанке
3.2.2 Филогенетический анализ видов рода Pleurotus
3.2.3 Анализ эволюционных расстояний между видами рода Pleurotus
3.3. Анализ половой совместимости в пределах комплексных видов рода Pleurotus. Мон-мои скрещивания
3.3.1 Анализ половой совместимости между видами P. cajor-caju и P. pulmonarius
3.3.2 Анализ половой совместимости между представителями вида P. cornucopiae
3.3.3 Анализ репродуктивной изоляции между коммерческими и природными штаммами Р. оэКеаШз
3.3.4 Уточнение видового статуса и разрешение «спорных» видов рода Р1еигоШ
3.4 Баркодинг видов рода Ркигош
3.5 Анализ генов половой совместимости у представителей рода Р1еиго1и$
3.5.1 Структура та1А локуса половой совместимости
3.5.2 Клонирование генов та!А локуса Р. о51геаШя
Глава 4. Заключение
Выводы
Список литературы
Благодарности
Приложения

Актуальность исследования. Представители базидиальных грибов рода Plenrotus (Fr.) Kumm., вешенка, хорошо известны и встречаются повсеместно. Виды рода Pleurotus широко распространены в лесных биоценозах средней полосы России, а также многие из них культивируются в пищевых целях. Видовой состав рода довольно разнообразен. Большинство видов рода съедобны или условно съедобны. Многие виды представляют биотехнологическую и медицинскую ценность, так как обладают пулом ферментов семейства пероксидаз (Bonatti et al., 2004). Показано также, что спиртовые и водные экстракты полисахаридов многих представителей данного рода обладают антиопухолевой и антиоксидантной активностью (Lakshmi et al., 2005; Sanchez, 2010). Данный род характеризуется сложной структурой видов. Зачастую точное определение видов в пределах рода Pleurotus затруднено в связи со схожестью морфологических характеристик, особенно если речь идет о комплексных видах, представленных интерстерильными группами. Морфология плодовых тел при культивировании вешенок также отличается вариабельностью признаков и, как показано, во многом зависит от условий выращивания (Sanchez, 2004; Avin et al., 2012). Поэтому классическое определение грибов на основе культурально-морфологических характеристик целесообразно сопровождать молекулярногенетическими методами анализа. В связи с этим поиск универсальных молекулярных маркеров и генотипнрование видов является одной из основополагающих задач современной таксономии, а также необходимо для создания и систематизации коллекции грибов.
Половое размножение и образование фертильного дикариотического мицелия и плодовых тел у базидиальных грибов контролируется генами локусов половой совместимости matA и matB. Локус mat А обладает вариабельной структурой и кодирует гомеодоменные белки (HD, homeodomain), гетеродимеры которых являются транскрипционными факторами, участвующими в регуляции процессов полового развития. Только гомеодоменные белки, синтезированные с разных аллелей matA локусов половых партнеров, могут сформировать активный гетероднмерный белок. Подобный механизм генетического контроля значительно уменьшает вероятность инбридинга и направлен на поддержание природного внутрипопуляционного полиморфизма. В связи с высокой вариабельностью последовательностей генов гомеодоменных белков (hä) и вариабельностью количества копий этих генов в пределах matA локуса, их изучение затруднено. Тем не менее, расшифровка структуры локусов и содержащихся в них последовательностей важна для понимания механизмов размножения и развития грибов, а также оптимизации процессов направленной селекции.

25-е сутки с момента колонизации субстрата мицелием (Таблица 4). Плодовые тела характерной розовой окраски появились лишь в апреле, когда продолжительность светового дня достигла 13 ч, а температура в лабораторной камере для культивирования повысилась до 25°С. При этом урожайность природного штамма 1526 вешенки розовой была высокой и составила за две волны плодоношения 84% по отношению к субстрату, что сопоставимо с продуктивностью культивируемых штаммов P. ostreatus и P. sajor-caju (Таблица 5).
Еще один съедобный вид, успешно формировавший плодовые тела в лабораторных условиях, - вешенка воронковидная, P. cormtcopiae. В исследовании были использованы два штамма — производственный Н-14 и природный изолят 88 (Таблица 4). Оба штамма культивировали во второй серии экспериментов (23°С, 11 ч световой день). Средняя урожайность штаммов была несколько ниже, чем у других культивируемых видов и достигала в среднем 60% от массы субстрата. При этом урожайность производственного штамма Н-14 была несколько выше (73%) по сравнению с природным изолятом 88 (49%) (Таблица 5).
Вид P. calyptratus относят к некультивируемым и несъедобным вешенкам. В эксперименте участвовали два природных изолята, взятых из разных коллекций, -московский изолят С-1 и киевский 1935. Штаммы культивировали как в первой, так и во второй серии экспериментов, однако, полноценные плодовые тела из примордиев были сформированы только во второй серии экспериментов (23°С, 11 ч световой день). Как и в природных условиях, гимений у формирующихся плодовых тел был покрыт частным покрывалом, которое со временем раскрывалось, оставляя бахрому по краю шляпки (Рисунок 3). Представители данного вида давали только одну волну плодоношения в среднем на 28-е сутки после инокуляции субстрата.
Вид P. cystidiosus, в типе образующий анаморфную коремиальную стадию, был способен продуцировать зрелые плодовые тела в лабораторных условиях (Таблица 4). Культивирование штамма AG 55/466 P. cystidiosus проводили во второй серии экспериментов. Интересно, что данный штамм показал наилучшие результаты как по продуктивности (урожайность составила 97% от массы сусбтрата), так и по срокам плодоношения первой волны (Таблица 5). В литературе встречается информация о промышленном культивировании вида P. cystidiosus, однако в России вид не пользуется популярностью для культивирования в пищевых целях (Kong, 2004).
О&нако следует отметить, что не для всех видов вешенок предложенные нами «лабораторные» условия культивирования оказались оптимальными. Так, определенная трудность возникла с получением плодовых тел у представителя вида P. eryngii. Согласно рекомендациям по промышленному культивированию, данный вид требует пониженных