Возрастные изменения экспресии генов VEGFA и PEDF при развитии дистрофии сетчатки у крыс OXYS

• Автор: Марковец, Антон Михайлович
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 151 с. : ил.

Оглавление

Список сокращений:

1. Введение, цели и задачи исследования

2. Обзор литературы

2.1 Клинические признаки возрастной макулярной дегенерации и его эпидемиология

2.2 Этиология возрастной макулярной дегенерации

2.2.1 Генетические факторы риска возрастной макулярной дегенерации

2.2.1.1 Роль генов системы комплемента и иммунной системы

2.2.1.2 Роль генов локуса HTRA1/ ARMS2

2.3 Патогенез возрастной макулярной дегенерации

2.3.1 Возрастные структурно-функциональные изменения сетчатки как основа развития заболевания
2.3.2 Роль факторов VEGF, PEDF и PHD2 в патогенезе возрастной макулярной дегенерации и их взаимодействие между собой
2.3.3 Гипоксия и окислительный стресс в патогенезе возрастной макулярной дегенерации
2.4 Потенциал антиоксидантов в профилактике/лечении возрастной макулярной дегенерации
2.4.1 Антиоксиданты адресованные в митохондрии - новый класс биологически активных молекул
2.5 Биологические модели возрастной макулярной дегенерации
2.5.1 Крысы линии OXYS как модель преждевременного старения и связанных с ним заболеваний
3. Материалы и методы
3.1 Животные и схема экспериментов
3.2 Оборудование
3.3 Офтальмологические осмотры исследуемых животных
3.4 Забор сетчатки и хранение материала
3.5 Выделение РНК из ткани сетчатки
3.6 Электрофорез РНК в агарозном геле
3.7 Очистка образцов РНК методом ДНКазной обработки
3.8 Реакция обратной транскрипции для получения кДНК
3.9 Приготовление смеси «стандартной» кДНК
3.10 Полимеразная цепная реакция в реальном времени (real-time PCR) для определения уровня мРНЗС исследуемых генов
3.11 Выделение общего белка сетчатки для Вестерн блот (Western blot)
3.12 Выделение белка для иммуноферментного анализа ELISA
3.13 Проведения Вестерн блот анализа
3.14 Проведение иммуноферментного анализа ELISA
3.15 Гистологический и морфометрический анализ сетчаток
3.16 Статистический анализ результатов
4. Результаты
4.1 Исследование возрастных изменений сетчатки крыс OXYS и Wistar
4.1.1 Офтальмологическая характеристика сетчатки крыс OXYS в возрасте от 20 дней до 24 месяцев
4.1.2 Морфологический анализ сетчатки крыс OXYS в возрасте от 20 дней до 24 месяцев
4.1.2.1 Морфометрический анализ клеток ретинального пигментного эпителия и сосудов хориоидеи сетчатки крыс OXYS и Wistar в возрасте от 20 дней до 24 месяцев
4.1.3 Уровень мРНК и содержание белка гена Vegfa в сетчатке крыс OXYS и Wistar в возрасте от 20 дней до 24 месяцев
4.1.4 Уровень мРНК в возрасте от 20 дней до 24 месяцев и содержание белка гена Pedf в возрасте от 20 дней до 12 месяцев сетчатке крыс OXYS и Wistar
4.1.5 Уровень мРНК гена Phd2 в сетчатке крыс OXYS и Wistar в возрасте от 20 дней до 12 месяцев
4.2 Исследование эффектов антиоксиданта SkQl на сетчатку крыс Wistar и
OXYS
4.2.1 Профилактическое применение SkQl с кормом
4.2.1.1 Офтальмологическая характеристика сетчатки крыс OXYS до и после курса антиоксиданта SkQl с кормом
4.2.1.2 Уровень мРНК и содержание белка гена Vegfa в сетчатке крыс OXYS и Wistar после курса SkQl с кормом в возрасте 3 месяцев
4.2.1.3 Уровень мРНК и содержание белка гена Pedf в сетчатке крыс OXYS и Wistar после курса SkQl с кормом в возрасте 3 месяцев
4.2.1.4 Уровень мРНК гена Phd2 в сетчатке крыс OXYS и Wistar после курса SkQl с кормом в возрасте 3 месяцев

переработка внешних сегментов фоторецепторов, что само по себе связано с генерацией АФК. Со старением клеток РПЭ происходит накопление окисленных липидов и клеточных компонентов, которые не могут быть утилизированы в лизосомах, что, по-видимому, приводит к образованию и накоплению липофусциновых гранул.
Одним из фотоактивируемых продуцентов АФК является компонент липофусциновых гранул А2Е. In vitro показана способность А2Е при воздействии синим светом дестабилизировать мембраны митохондрий и лизосом и ингибировать цитохром оксидазы дыхательной цепи митохондрий. При этом его токсический эффект прямо зависит от количественных характеристик светового воздействия (Strauss, 2005).
Окислительные повреждения происходят в углеводах, липидах мембран, белках и нуклеиновых кислотах и в наибольшей степени затрагивают митохондрии - основной источник АФК в клетках, которые вследствие недостатка протекторных гистонов и ДНК-репарирующих систем в митохондриальном геноме сами становятся мишенью окислительного стресса. В результате уровень окислительных модификаций оснований в ДНК митохондрий в 10 раз выше, чем в ядерной ДНК (Miquel, 1992). Накопление окислительных повреждений липидов, белков и ДНК в митохондриях может приводить к угнетению энергетического метаболизма, усилению генерации АФК и активации апоптоза. Недавно опубликована работа (Wang et al, 2008), в которой сообщается о более высоком уровне окислительных повреждений в ДНК митохондрий по сравнению с ядерной ДНК, на фоне сниженной