Центр инактивации X-хромосомы обыкновенных полевок: характеристика последовательностей ДНК и анализ экспрессии генов

• Автор: Малахова, Анастасия Александровна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 111 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Феноменология инактивации Х-хромосомы у млекопитающих

1.1.1. Основные положения

1.1.2. Процесс инактивации Х-хромосомы в системе ЭС клеток

1.1.3. Стадии процесса инактивации Х-хромосомы

1.1.4. Импринтированная инактивация Х-хромосомы

1.1.5. Сверхэкспрессия генов Х-хромосом

1.2. Структура центра инактивации Х-хромосомы

1.3. Ген АнТ
1.4. Ген Т/х
1.5. Характеристика хроматина неактивной Х-хромосомы
1.6. Стадии процесса инактивации и роль генетических элементов
1.6.1. Факторы, участвующие на стадиях подсчета и выбора неактивной Х-хромосомы
1.6.2. Стадия инициации инактивации
1.6.3. Стадия распространения сигнала инактивации по Х-хромосоме
1.6.4. Поддержание неактивного состояния Х-хромосомы
1.7. Участие механизма РНК-интерференции в процессе инактивации Х-хромосомы
1.8. Модели инициации случайной инактивации Х-хромосомы
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Объекты исследования
2.2. Скрининг фаговой геномной библиотеки полевки М1сгоЫ$ rossia.emeridiona.lis
2.3. Выделение фаговой ДНК
2.4. Микробиологические методы работы
2.5. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса
2.6. Методы работы с рекомбинантной ДНК

2.6.1. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции
2.6.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.6.3. Выделение фрагментов ДНК из гелей
2.6.4. Лигирование
2.7. Выделение ДНК и РНК из плацент
2.8. Синтез кДНК методом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР)
2.9. Полимеразная цепная реакция
2.10. 3’- и 5’-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)
2.11. Определение нуклеотидной последовательности ДНК
2.12. Контекстный анализ последовательности ДНК
2.13. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)
2.14. PHK-FISH
З. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Определение нуклеотидной последовательности 5’-конца гена Tsix полевки Microtus rossiaemeridionalis
3.2. Сравнительный анализ 5’-конца гена Tsix грызунов
3.3. Сравнительный анализ локусаXist/Tsix млекопитающих
3.4. Характеристика регуляторных последовательностей гена Tsix полевки
3.4.1. DXPas34
3.4.2. Промоторная область гена Tsix
3.5. Анализ генетического окружения локуса Xist/Tsix
3.6. Экспрессия и экзон-интронная структура гена Tsix
3.7. Экспрессия последовательностей локусаXist/Tsix полевки
3.7.1. Экспрессия гена Slc7a3
3.7.2. Экспрессия в 5’- фланкирующей области гена Tsix
3.7.3. Экспрессия гена Tsix
3.7.4. Экспрессия генаXist
3.7.5. Экспрессия в 5’- фланкирующей области гена ХА?
3.7.6. Экспрессия гена Епох
3.7.7. Хромосомоспецифичность экспрессии генов локуса Хіс у обыкновенных полевок

Одиако в 2006 году было установлено, что накопление транскрипта Xist на стадии инициации инактивации связано не с его стабилизацией, а с возрастанием уровня транскрипции Xist на будущей неактивной Х-хромосоме (Sun et al., 2006). Ранние исследования, в которых был сделан вывод о стабилизации транскрипта Xist, проводили еще до открытия антисмыслового гена Tsix. В этих экспериментах для обнаружения транскрипта Xist в качестве зонда использовали не цепь-специфичную, а двухцепочечную ДНК, которая, по-видимому, выявляла сигнал не смыслового, а антисмыслового транскрипта. При помощи метода конкурентной ОТ-ПЦР установлено, что РНК Xist присутствует в недифференцированных ЭС-клетках самок мыши в количестве примерно 10 копий, а на стадии установления инактивации X-хромосомы накапливается более 300 копий транскрипта на клетку. В ЭС-клетках самцов выявляется- не более 3-4 молекул РНК Xist (Sun et al., 2006). Показано, что время полужизни транскрипта Xist в недифференцированных ЭС-клетках как самок, так и самцов равна приблизительно 6 часам (Sun et al., 2006), а не 0,5 часам, как сообщалось ранее (Panning* et al., 1997; Sheardown et al., 1997), и не меняется значительно во время дифференцировки. Более того, на линиях ЭС-клеток самок и самцов мыши, несущих мутацию по* гену Tsix, показано, что отсутствие РНК Tsix в клетке не изменяет время полужизни транскрипта Xist. Таким образом, Tsix не оказывает влияния на стабильность РІЖ Xist. Стабильность транскрипта показана также для-трансгена Xist мыши (время полужизни составляет 5-6 часов) (Wutz and Jaenisch, 2000) и XIST человека* (Clemson et al., 1998).
Исследование района 540 п.н. промотора Xist с помощью люциферазных репортерных конструкций в* ЭС-клетках на стадиях до и после инактивации X-хромосомы показало, что в клетках с набором гоносом XY активность промотора Xist низка до начала инактивации Х-хромосомы, и остается низкой во время дифференцировки клеток, что согласуется с данными об отсутствии накопления РНК Xist у самцов (Sun et al., 2006). В клетках XX активность промотора была низкой до начала Х-инактивации, но во время дифференцировки повышалась в 2-10 раз. По-видимому, фрагмент промоторной последовательности длиной 540 п.н. не содержит всех генетических элементов, необходимых для достижения полного 31-кратного повышения уровня экспрессии гена Xist, характерного для гена Xist в дифференцирующихся ЭС-клетках самок.