Структурная организация и механизмы действия ФМН-зависимых рибопереключателей у бактерий

• Автор: Склярова, Светлана Анатольевна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 132 с. : ил.

Оглавление
ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Биосинтез рибофлавина и его производных у бактерий

1.1. Пути биосинтеза рибофлавина у бактерий

1.1.1. ГТФ-циклогидролаза II

1.1.2. Редуктаза и дезаминаза

1.1.3. Дефосфорилирование 5-амино-6-(рибитиламино)-2,4( 1Н,ЗН)-пиримидиндион-5'-фосфата

1.1.4. 3,4-дигидрокси-2-бутанон-4-фосфатсинтаза

1.1.5. Люмазинсинта

1.1.6. Рибофлавинсинтаза
1.1.7. Биосинтез флавиновых нуклеотидов, ФМН и ФАД
1.2. Гены биосинтеза рибофлавина и его производных
2. Регуляция экспрессии генов посредством рибопереключателей у бактерий
2.1. Разнообразие рибопереключателей у бактерий
2.2. Аналоги лигандов рибопереключателей как антимикробные соединения
2.3. Механизмы действия рибопереключателей
2.3.1. Роль Шю-фактора в регуляции экспрессии генов с участием рибопереключателей
2.4. Структурная организация рибопереключателей
2.5. ФМН-связывающие рибопереключатели
2.5.1. Пространственная структура /^п-элемента
2.5.2. Механизмы действия ФМН-связывающих
рибопереключателей
2.5.2.1. Регуляция генов, вовлеченных в биосинтез рибофлавина.
2.5.2.2. Регуляция генов, вовлеченных в транспорт рибофлавина.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Бактериальные штаммы и плазмиды
3.2. Состав питательных сред, используемых для выращивания бактерий
3.3. Выделение хромосомной ДНК из бактерий B.subtilis
3.4. Выделение плазмидной ДНК из E.coli
3.5. Трансформация бактерий
3.5.1. Трансформация E.coli
3.5.2. Трансформация B.subtilis
3.6. Конструирование транскрипционных фьюзов ribP 1.3-lacZ в гене атуЕ хромосомы B.subtilis
3.7. Конструирование транскрипционных фьюзов, локализованных в области r/'è-оперона B.subtilis
3.8. Сайт-направленный мутагенез
3.9. Конструирование транскрипционных и трансляционных фьюзовураА-lacZ в гене атуЕ хромосомы B.subtilis
3.10. Конструирование транскрипционных фьюзов ribB-lacZ
3.11. Определение активности ß-галактозидазы
3.11.1. В культуре клеток E. coli
3.11.2. В культуре клеток B.subtilis
3.12. Выделение суммарной РНК из бактериальных клеток
3.13. Определение старта транскрипции
3.14. Транскрипция in vitro
3.15. Транскрипция in vitro на твердой фазе
3.15.1. Определение расположения Rho-независимого терминатора транскрипции генаураА B.subtilis
3.15.2. Транскрипция лидерной области гена rïbB E.coli в очищенной системе in vitro
3.16. Анализ формирования ЗОБ-инициаторного комплекса на мРНК
(тоупринт-анализ)
3.17. Анализ вторичной структуры РНК («In-line probing»)
3.18. Количественная ПЦР (RT-qPCR)
РЕЗУЛЬТАТЫ
4. Изучение структурно-функциональной организации внутренних промоторов рибофлавинового оперона В. subtilis
4.1. Определение старта транскрипции внутренних промоторов Р2 и РЗ rib-оперона
4.2. Оценка силы промоторов nè-оперона
4.3. Определение уровня транскрипции генов ribB, rib А и ribT в составе r/è-оперона
4.4. Изучение уровня транскрипции генов r/6-оперона с помощью RT-qPCR
5. Исследование регуляции экспрессии гена ypaA B.subtilis
5.1. Определение структуры промотора тенаураА B.subtilis
5.2. Изучение экспрессии транскрипционных и трансляционных фьюзов ypaA-LacZ в клетках штамма В. subtilis RKH25 и его изогенного варианта
В. subtilis RKH25-C
5.3. Влияние ФМН на формирование ЗОБ-инициаторного комплекса на лидерной мРНК тенаураА B.subtilis
5.4. Транскрипция in vitro тенаураА на твердой фазе
5.5. Изучение экспрессии транскрипционных фьюзов ypaA-LacZ в клетках штамма В. subtilis RibBllO
5.6. Транскрипция лидерной мРНК тенаураА дикого типа и ее мутантных вариантов в системе in vitro
5.7. Изучение вторичной структуры лидерной мРНК гена ураЛ методом гидролиза («In line probing»)
6. Исследование регуляции экспрессии гена ribB E.coli
6.1. Изучение экспрессии транскрипционных фьюзов ribB-LacZ в клетках штамма E.coli АМ4
6.2. Определение доли полноразмерного транскрипта гена ribB методом «достройки праймера»

гистон-подобным белком H-NS, сайт связывания которого на ДНК-матрице располагается вблизи сайта Rho-зависимой терминации [111].
Методом иммунопреципитации хроматина и микроэррей анализа (Chip-chip) было показано, что у E.coli Rho-зависимая терминация приводит к образованию малых РНК[112]. Так, малая РНК SroG соответствует лидерной области гена ribB, кодирующего один из ферментов биосинтеза рибофлавина, и ранее была идентифицирована в работе [142]. Такая малая РНК содержит последовательность аптамерного домена ФМН-связывающего рибопереключателя, получившего название r/н-элемента. Известно, что регуляция экспрессии гена ribB осуществляется ФМН-зависимым рибопереюпочателем на уроне инициации трансляции, т.е. в результате связывания лидерной мРНК с ФМН формируется шпилечная структура секвестра, блокирующего SD-последовательность для связывания с рибосомой [4]. Таким образом, было высказано предположение, что Rho-фактор может играть второстепенную роль в регуляции экспрессии генов с участием рибопереключателей, контролирующих инициацию трансляции прилегающих генов [22]. Согласно такой гипотезе, образование малой РНК SroG происходит, когда Rho-фактор терминирует транскрипцию гена ribB E.coli в отсутствии его трансляции.
2.4. Структурная организация рибопереключателей
Самый простой вариант структурной организации рибопереключателя представляет собой соединение аптамерного домена, распознающего и связывающего определенный метаболит, и следующей за ним экспрессионной платформы (рис. 8). Для осуществления регуляторных функций рибопереключателями такой простой архитектуры требуется 81-кратное изменение концентрации лиганда. Для того чтобы настроить систему генетической регуляции в клетке более сложным образом, рибопереключатели используют сочетание нескольких аптамерных доменов