Анализ структуры генов изолятов вируса африканской чумы свиней, выделенных на территории Российской Федерации

• Автор: Варенцова, Алиса Алексеевна
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Владимир
• Количество страниц: 140 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
1 ВВЕДЕНИЕ
1Л Актуальность темы исследования
1.2 Степень разработанности проблемы
1.3 Цели и задачи исследования
1.4 Научная новизна результатов исследований
1.5 Теоретическая и практическая значимость работы
1.6 Методология и методы исследования
1.7 Положения, выносимые на защиту
1.8 Личный вклад соискателя
1.9 Степень достоверности и апробация результатов работы
1.10 Публикации
1.11 Объем и структура диссертации
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1 Африканская чума свиней, эпизоотологическая ситуация
2.2 Разнообразие изолятов и штаммов вируса АЧС
2.3 Современная классификация изолятов и штаммов вируса АЧС
2.4 Структура вириона
2.5 Характеристика основных, структурных и диагностически значимых белков вируса АЧС
2.6 Характеристики изолятов и штаммов вируса АЧС
2.7 Основные направления разработки специфических средств профилактики АЧС
2.8 Клонотеки генов в изучении возбудителя АЧС
2.9 Заключение по обзору литературы
3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1 Материалы
3.2 Методы
4 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1 Создание клонотеки генов вируса АЧС
4.1.1 Определение расположения и направления считывания ОРС генов B646L, CP204L, KP177R, 061R, EP402R, CP530R, CP2475L и E183L в полноразмерном геноме вируса АЧС штамма Грузия 2007/
4.1.2 Подбор праймеров и оптимизация параметров ПЦР
4.1.3 Клонирование генов вируса АЧС
4.1.4 Клонотека генов вируса АЧС изолята Krasnodar06/
4.2 Использование клонотеки генов для создания продуцентов
4.2.1 Клонирование копии гена K177R в экспрессирующей плазмиде рЕТ32Ь(+)
4.2.2 Анализ экспрессии р22 в клетках E.coli
4.2.3 Анализ нуклеотидных последовательностей генов вируса АЧС
4.3 Изучение культурально-биологических свойств изолята Krasnodar 06/12 и адаптация его к репродукции в перевиваемых культурах клеток
4.3.1 Выделение вируса АЧС из патологического материала и первичный анализ свойств изолята Krasnodar 06/
4.3.2 Изучение биологических свойств изолята Krasnodar 06/
4.3.3 Патологоанатомические изменения у свиней, зараженных изолятом Krasnodar 06/12 вируса АЧС
4.3.4 Сравнительный анализ молекулярно-биологических свойств изолятов вируса АЧС, выделенных на территории РФ в 2007-2013 гг
4.3.5 Адаптация изолята Krasnodar 06/12 к репродукции в перевиваемых культурах клеток
4.3.6 Изучение биологических свойств вируса АЧС, изолята Krasnodar 2/13, адаптированного к росту в перевиваемой культуре клеток РК-
4.4 Получение аттенуированного варианта вируса АЧС
4.4.1 Аттенуация изолята Krasnodar 2/13, адаптированного к росту в перевиваемой культуре клеток РК-
4.4.2 Изучение возможности использования адаптированного штамма для приготовления культурального антигена для постановки ТФ ИФА
4.4.3 Использование культурального антигена вируса АЧС для постановки РНИФ
4.5 Обсуждение результатов
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
5.1 Выводы
5.2 Практические предложения
5.3 Перспективы дальнейшей разработки темы
6 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
7 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
8. СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА
9 ПРИЛОЖЕНИЯ

С.С. Abrams с соавторами в своей работе по разработке альтернативной вакцины используют аттенуированные штаммы вируса АЧС для создания делеционных по различным генам мутантов вируса, иммунизация которыми не вызовет проявление клинических признаков болезни, но обеспечит эффективную защиту. Поскольку ранее установлено, что аттенуированный штамм OURT88/3 защищает от заражения свиней вирулентным штаммом OURT88/1, в 2013 году группой ученых был получен делеционный мутант данного штамма вируса АЧС по генам DP71L и DP96R, обуславливающих устойчивость свиней к заболеванию. В результате проведенных исследований установлено, что делеция данных генов не влияет на репродукцию вируса в культуре клеток макрофагов свиньи, но при контрольном заражении гомологичным вирулентным штаммом вируса АЧС иммунизированных делеционным мутантом свиней установлено снижение устойчивости к вирусу свиней до 66%, по сравнению с исходным аттенуированным вариантом, защищающим 100% свиней [74].
Несмотря на то, что работами отечественных и зарубежных исследователей была доказана возможность создания 100% защиты против гомологичного изолята, оставался открытым вопрос о создании специфической защиты от заражения гетерогенными изолятами вируса АЧС.
Разработки по конструированию поливалентной вакцины против гетерогенных по иммунотиповой принадлежности возбудителя изолятов, проведенное сотрудниками ВНИИВВиМ, подтвердили эффективность комплексной иммунизации несколькими авирулентными клонами, против гетерогенного изолята Киравира, имеющего в своем составе варианты 3, 5 и 6 серотипов. В проведенных ими экспериментах достигнута 100% защита животных от контрольного заражения гетерогенным вирулентным изолятом [24].
Таким образом, была доказана возможность создания защиты и против заражения гетерогенным по сероиммунотиповому составу изолятом вируса АЧС.