Генетическая изменчивость и антигенные свойства штаммов пандемического вируса гриппа А (H1N1), циркулировавшего в 2009–2010 годах на территории Российской Федерации

• Автор: Шиков, Андрей Николаевич
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 139 с. : 8 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Классификация вирусов гриппа

1.2. Морфология вируса гриппа А

1.3. Сегменты генома и кодируемые ими белки

1.4. Репликативный цикл вируса гриппа

1.5. Генетическая и антигенная изменчивость вируса гриппа А

1.6. Молекулярные детерминанты патогенности, рецепторной специфичности и лекарственной резистентности вируса гриппа А

1.7. Особенности пандемии, вызванной вирусом гриппа А(НШ1)рбт09

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.1.1. Реактивы и наборы реагентов, использованные в работе
2.1.2. Культуры клеток
2.1.3. Развивающиеся куриные эмбрионы (РКЭ)
2.1.4. Оборудование
2.1.5. Образцы для исследования и выделения вирусных штаммов
2.2. Методы
2.2.1. Выделение вируса из клинического и секционного материала
2.2.2. Реакция гемагглютинации
2.2.3. Получение иммунных сывороток
2.2.4. Определение титра противовирусных антител в сыворотке крови инфицированных мышей в реакции торможения гемагглютинации

2.2.5. Выделение вирусной РНК из исследуемых образцов
2.2.6. Реакция обратной транскрипции
2.2.7. Полимеразная цепная реакция
2.2.8. Электрофоретический анализ и выделение из агарозного геля фрагментов ДНК
2.2.9. Секвенирование ДНК
2.2.10. Анализ нуклеотидных последовательностей
2.2.11. Визуализация позиций аминокислотных остатков
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Выделение штаммов пандемического вируса гриппа А(НШ1)рс1т09
3.2. Изучение антигенных свойств штаммов пандемического вируса гриппа А (НШ1) рбт09 методом РТГА
3.3. Филогенетический анализ генов НА и ТЧА штаммов пандемического вируса гриппа А (НШ1) рбт09
3.4. Изучение генетической изменчивости штаммов пандемического вируса гриппа А(НШ1) рбт09
3.5. Анализ аминокислотных последовательностей вирусных белков штаммов пандемического вируса гриппа А (НШ1) рбш09
3.6. Изучение генетической гетерогенности выделенных штаммов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Приложение

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
а.о. - аминокислотный остаток
ВАЖ - вируссодержащая аллантоисная жидкость
ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения
вРНК - вирусная рибонуклеиновая кислота
ДВС - диссеминированное внутрисосудистое свертывание
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ИФН - интерферон
кРНК - комплементарная рибонуклеиновая кислота
мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота
н.о. - нуклеиновое основание
ОНП - однонуклеотидный полиморфизм
ОРДС - острый респираторный дистресс-синдром
ОТ - обратная транскрипция
ОТ-ПЦР - обратнотранскриптазная полимеразная цепная реакция
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РТА - реакция гемагглютинации
РКЭ - развивающиеся куриные эмбрионы
РНК - рибонуклеиновая кислота
РТГА - реакция торможения гемагглютинации
ЭИД50 - 50% эмбриональная инфицирующая доза
CDC - Center for Disease Control and Prevention (Центр по контролю и предотвращению заболеваний)
CPSF4 - cleavage and polyadenylation specificity factor subunit 4 (фактор специфичности связывания и полиаденилирования, субъединица 4)
ddNTP - дидезоксирибонуклеозидтрифосфат

ниженной репликативной способностью вируса в клетках верхних дыхательных путей у млекопитающих.
Другая мутация в белке РВ2 - D701N также связана с повышением вирулентности вируса гриппа А у млекопитающих. Наличие мутации D701N в белке РВ2, а также мутации N319К в белке NP, повышает связывание этих белков с импортином-al и тем самым увеличивает их транспорт из цитоплазмы в ядро клеток млекопитающих. При этом в клетках птиц такие эффекты при наличии этих мутаций не наблюдались (Gabriel et al., 2008). Кроме того, мутация D701N, как и Е627К, по-видимому, тоже является адаптивной, поскольку была обнаружена у изолятов высокопатогенного вируса гриппа птиц субтипов Н5 и Н7, выделенных от заболевших людей (Steel et al., 2009).
У пандемического вируса гриппа A (H1N1) pdm09 в РВ2 отсутствуют мутации Е627К и D701N, связанные с высокой патогенностью. Однако в РВ2 этот вирус имеет компенсационные мутации G590S и Q591R, которые влияют на активность полимеразы и увеличивают репликацию вируса в человеческих и свиных клетках (Mehle, Doudna, 2009).
Патогенность вируса гриппа А также определяет белок PB1-F2. В клетке этот белок связывается с митохондриями и снижает мембранный потенциал митохондрий, что приводит к высвобождению цитохрома и индукции апоптоза CD8+ Т-лимфоцитов и моноцитов (Chen et al., 2001). Кроме того, известно, что снижением митохондриального мембранного потенциала белок PB1-F2 ингибирует MAVS-опосредованный синтез интерферонов I типа (Varga et al., 2012). Замещение аминокислоты N66S в этом белке приводит к более эффективному связыванию с белком MAVS, что, по-видимому, является причиной увеличения вирулентности и патогенности вируса гриппа А у мышей (Conenello et al., 2011; Varga et al., 2012). Пандемический вирус гриппа A (H1N1) pdm09 экспрессирует усеченный вариант PB1-F2 длиной 11 а.о. Одно из исследований показало, что рекомбинантные штаммы вируса пандемического гриппа A (H1N1) pdm09, экспрессирующие белок PB1-F2 с мута-