Повышение качества вакцин против гриппа A/H5N1 путем увеличения стабильности гемагглютинина и использования нового донора репродукции

• Автор: Сергеева, Мария Валерьевна
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 145 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Появление высокопатогенных вирусов гриппа A/H5N1 и разработка противопандемических вакцин
1.2 Создание вакцинных штаммов для производства вакцин против вирусов гриппа A/H5N
1.3 Гемагглютинин высокопатогенных вирусов гриппа A/H5N1 в составе вакцинных препаратов
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Материалы
2.2 Молекулярно-биологические методы
2.3 Вирусологические методы
2.4 Подготовка и характеристика прототипов инактивированных гриппозных вакцин
2.5 Иммунологические и серологические методы
2.6 Работа с животными
2.7 Методы статистической обработки данных
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1 Получение и характеристика реассортантов AT15N1 на основе донора репродукции A/Puerto Rico/8/34 с комбинированным составом генома
3.2 Повышение стабильности гемагглютинина реассортантов H5N1/PR8 путем точечного мутагенеза
3.3 Получение и характеристика реассортанта A/H5N1 на основе нового
универсального донора А/Гонконг/1/68/162/3

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ
Приложение 1. Вирусы, использованные в филогенетическом анализе
Приложение 2. Нуклеотидные последовательности праймеров
Приложение 3. Аминокислотные последовательности НА высокопатогенных вирусов и реассортантов Н5М1/Р
Приложение 4. Нуклеотидные последовательности НА реассортантов Н5Ш/РР8 по данным частичного секвенирования
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
БСА - бычий сывороточный альбумин
в/м - внутримышечно
ГАЕ - гемагглютинирующая единица
ЖГВ - живая гриппозная вакцина
ИГВ - инактивированная гриппозная вакцина
и/н - интраназально
ИФА - иммуноферментный анализ
КББ - карбонатно-бикарбонатный буфер
КК - культура клеток
КЭ - куриные эмбрионы
ОП - оптическая плотность
ОТ - обратная транскрипция
н/о - не определяли
ПААГ - полиакриламидный гель
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РГА - реакция гемагглютинации
РТГА - реакция торможения гемагглютинации
ТИД50 - 50% тканевая инфекционная доза
ФБС - фетальная бычья сыворотка
ФСБ - фосфатно-солевой буфер
ЭИД50 - 50% эмбриональная инфекционная доза
ЭФ - электрофорез
DPBS - Dulbecco modified phosphate buffered saline (ФСБ в модификации Дульбекко, без ионов Са2+ и Mg2+)
НА - hemagglutinin (гемагглютинин)
NA - neuraminidase (нейраминидаза)
RCT - reproductive capacity at different temperatures (изменение показателя репродукции при различных температурах)
данной мутации обеспечивало снижение pH слияния НА высокопатогенного вируса гриппа A/H7N1 на 0,7 единиц. При искусственном введении данной мутации в НА штамма Х-31 (H3N2) было продемонстрировано аналогичное снижение pH слияния (Steinhauer et al., 1991).
Переход НА в состояние конформации, характерной для кислого pH, может быть вызван не только снижением pH, но также повышением температуры и действием денатурирующих агентов. Это связано с тем, что нативное состояние молекулы НА метастабильно, а структура изменённой конформация является более термодинамически выгодной (Carr et al., 1997). Введение точечной мутации К5821 в НА вируса гриппа A/Vietnam/1203/04 (H5N1) приводило не только к снижению pH активации до уровня, показанного для человеческих вирусов, но таюке повысило стабильность вируса к действию кислой среды и повышенной температуры. (Krenn et al., 2011). В другом исследовании снижение pH активации НА высокопатогенного вируса гриппа A/H5N1 повысило устойчивость данного вируса в окружающей среде (Reed et al., 2010). Приведенные результаты говорят о том, что чем ниже pH слияния, тем более устойчивой является нативная структура НА. Таким образом, НА высокопатогенных вирусов гриппа птиц A/H5N1 является менее стабильным по сравнению с НА вирусов гриппа человека.
1.3.2 Гемагглютинин - основной антиген противогриппозных вакцин
Важное место в процессе разработки противогриппозных вакцин
отводится контролю специфичности, активности, иммуногенности и
безопасности препаратов. Наличие и концентрация адъювантов,
стабилизаторов, примесей, присутствие агрегатов влияют на безопасность
вакцины, и, во многом, определяют реакцию иммунной системы в ответ на
введение препарата. Однако наиболее значимым параметром является
количественное содержание в вакцине основного действующего антигена -
белка НА. В естественных условиях НА играет ключевую роль в начале