Экспериментальные препараты на основе рекомбинантных ДНК и белков для лечения и профилактики инфекционных заболеваний

• Автор: Лебедев, Леонид Рудольфович
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 256 с. : 56 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Часть I ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Цели и задачи исследования

Научная новизна и практическая значимость работы

Основные положения, выносимые на защиту

Апробация работы

Часть II ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.Получение рекомбинантных белков для создания медицинских 12 препаратов

2.Способы создания вакцинных препаратов и молекулярных 44 конструкций для использования в медицинской практике

Часть III МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Часть IV РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 1. Создание препаратов рекомбинантных белков медицинского
назначения
1.1.Изучение стабильности штаммов-продуцентов 119 рекомбинантных белков и разработка способов повышения их продуктивности
1.2. Получение рекомбинантных белков, предназначенных для 130 использования в качестве противовирусных препаратов, иммуномодуляторов и адыовантов
1.2.1. Получение препаратов ннтерферона-гамма и его 130 антагонистов, разработка технологий их очистки
1.2.2. Получение препаратов факторов некроза опухолей и их 142 антагонистов, разработ ка технологий их очистки
1.3.Получение рекомбинантных белков - антигенов для создания 157 вакцинных препаратов против вируса иммунодефицита (ВИЧ)
1.3.1. Получение белка-антигена ТВ1 (кандидата в вакцины 157 против ВИЧ-1)
1.3.2.Получснне искусственного антигена ВИЧ

полиэпитопного белка ТС1 Глава 2. Создание молекулярных конструкций вирусоподобных нанобиочастиц для получения на их основе лечебных и профилактических препаратов
2.1. Выбор и исследование полинуклеотидного комплекса для создания молекулярных конструкций вирусоподобных нанобиочастиц
2.2. Повышение иммуногенности коротких пептидов с помощью вирусоподобных нанобиочастнц
2.3. Создание самособнрающихся вирусоподобных нанобиочастнц - вакцинных препаратов на основе принципов аффинного взаимодействия компонентов
2.4. Создание вирусоподобных нанобиочастнц - вакцинных препаратов, содержащих белки, ковалентно связанные с матрицей
2.5. Подходы к разработке вирусоподобных нанобиочастнц для доставки генов в клетки с целыо создания ДНК-вакцин и терапевтических препаратов
2.6. Конструирование искусственных иммуногенов -вирусоподобных нанобиочастнц - кандидатов в ДНК-белковые вакцины
2.7. Создание комбинированных искусственных иммуногенов -кандидатов в вакцины
Заключение
Часть V ВЫВОДЫ
Список опубликованных работ по теме диссертации Часть VI Библиографический список

Список сокращений
AT - антиген
АЗКЦ — антителозависимая клеточная цитотоксичность АПК - антиген-презентирующая клетка АПК - антигенпрезентирующие клетки АТ — антитела
а. о. — аминокислотный остаток
в/б - внутрибрюшинное
в/м - внутримышечное
ВИО - вирус иммунодефицита обезьян
ВИЧ-1 - вирус иммунодефицита человека первого типа
ВПЧ — вирусоподобная частица
Г-КСФ (G-CSF) - Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор
ГМ-КСФ (GM-CSF) - Гранулоцитарномакрофагальный колониестимулирующий фактор
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
дсРНК - двуспиральная рибонуклеиновая кислота
ИО - иммунный ответ
ИС - иммунная система
ИФА - иммуноферментный анализ
ИФН (IFN) - интерферон
МАТ - моноклональные антитела
МНС - главный комплекс гистосовместимости
об/мин — оборотов в минуту
п. н. — пар нуклеотидов
ПАФ - полный адъювант Фрейнда
СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита
Тх - хелперные Т-лимфоциты
ФИО (TNF) - фактор некроза опухоли
ФСП - Фармакопейная статья предприятия
ЦТЛ - цитотоксические Т-лимфоциты
GST - (glutathione- S-transferase) - глутатион- S-трансфераза
lg - иммуноглобулин
OD - optical density (оптическая плотность)
TBI - Т- и В-клеточный иммуноген TCI — Т-клеточный иммуноген

Индукцию гена осуществляли с помощью индолилакриловой кислоты. Полученные клетки содержали ФНО-бета до 34% от общей массы клеточных белков. Высокое содержание целевого полипептида в биомассе позволило очистить белок практически за одну стадию. Последующая хроматография на колонке с детоксигелем была использована для удаления примесей бактериального эндотоксина. Выход лимфотоксина в этом процессе составил около 8 мг из 1 л клеточной культуры. В работе [253] сообщается о еще большем содержании ФНО-бета в биомассе при использовании плазмиды pETlld-TNF-b и реципиентного штамма E.coli BL21. Содержание ФНО-бета достигало 80% от суммарного клеточного белка, тогда как при использовании в качестве клеток-хозяев штамма E.coli 7118 - 17%. Но достичь такого высокого содержания целевого белка удается только в небольших объемах среды для культивирования и, следовательно, для небольших количеств биомасс, т.е. в аналитических вариантах. Предложенные в работе [256] процедуры получения и очистки ФНО-бета многостадийны, трудоемки и требуют дорогостоящих сорбентов для хроматографий. В одной из последних работ для получения препарата ФНО-бета [37] Денисов A.A. с сотр., используя рекомбинантный штамм E.coli SG 200-50/pLT21,предложили трехстадийную схему очистки:
Экстракт Г ель-фильтрация Хроматография на Хроматография на
клеток G-150 ДЕАЕ-сефадексе КМ-сефадексе
При использовании этой схемы они получали до 10 мг препарата за одну процедуру (из 4 л клеточной суспензии штамма-продуцента) и достигали степени его очистки в 96,7 раза. Это значение свидетельствует о низком содержании ФНО-бета в исходной клеточной массе, следовательно -неоптимальных условиях культивирования. Стадия гель-фильтрации на сефадексе G-150 грубого экстракта клеток трудномасштабируема и неоптимальна. В то же время для производства препарата (до 100 мг и выше) требуется масштабируемый процесс и большие количества биомассы.