Выявление герпесвируса сибирского осетра с помощью ПЦР в режиме реального времени и молекулярно-генетическая характеристика изолятов вируса

• Автор: Калабекова, Фатима Султанхамидовна
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Покров
• Количество страниц: 106 с. : ил.

Содержание

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность работы

1.2 Степень разработанности проблемы

1.3 Цель и задачи исследований

1.4 Научная новизна результатов исследований

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы

1.6 Степень достоверности и апробация работы

1.7 Соответствие содержания диссертации паспорту специальности, по которой она рекомендуется к защите

1.8 Публикации

1.9 Структура и объем диссертации
1.10 Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту
1.11 Личный вклад автора в выполнение работы
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1 Состояние осетроводства в мире и проблемы его развития
2.2 Вирусы и вирусные болезни рыб
2.3 Герпесвирусы рыб
2.4 Герпесвирусы осеровых рыб
2.5 Герпесвирусная болезнь сибирского осетра
2.6 Эпизоотологические особенности герпесвируса сибирского осетра..
2.7 Свойства возбудителя герпесвируса сибирского осетра
2.8 Клинические признаки и патологоанатомические изменения
2.9 Диагностика герпесвирусной болезни сибирского осетра
2.10 Профилактика герпесвирусной болезни сибирского осетра
2.11 Филогенетический анализ генома герпесвирусов рыб
2.12 Заключение по обзору литературы

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1 Материалы
3.1.1 Вирус
3.1.2 Рыба
3.1.3 Культуры клеток
3.1.4 Плазмида и бактериальные штаммы
3.1.5 Питательные среды, дезагрегирующие растворы, сыворотка и антибиотики
3.1.6 Растворы и реактивы
3.1.7 Лабораторное оборудование и принадлежности
3.2 Методы
3.2.1 Расчет праймеров и зонда
3.2.2 Выделение ДНК
3.2.3 Оценка специфичности тест-системы
3.2.4 Параметры постановки ПЦР с электрофоретической детекцией и ПЦР в режиме реального времени
3.2.5 Оценка аналитической чувствительности тест-системы
3.2.6 Оценка воспроизводимости тест-системы
3.2.7 Нуклеотидное секвенирование и филогенетический анализ
3.2.8 Культивирование герпесвируса сибирского осетра в перевиваемых культурах клеток осетровых рыб и определение его инфекционной активности
3.2.9 Экспериментальное заражение рыб
3.2.10 Выделение вируса от зараженных рыб
3.2.11 Программное обеспечение и интернет-ресурсы
3.2.12 Статистическая обработка результатов исследований
3.3 Результаты собственных исследований
3.3.1 Разработка тест-системы для выявления генома герпесвируса сибирского осетра на основе ПЦР в режиме реального времени

3.3.2 Определение специфичности тест-системы для выявления герпесвируса сибирского осетра
3.3.3 Оценка аналитической чувствительности тест-системы.
3.3.4 Оценка повторяемости результатов, полученных при использовании тест-системы
3.3.5 Схема подготовки проб различных органов и тканей рыб и оценка их диагностической ценности
3.3.6 Сравнительная эффективность выявления герпесвируса сибирского осетра на основе ПЦР в режиме реального времени и вирусовыделения в культуре клеток
3.3.7 Конструирование рекомбинантного положительного контроля амплификации к тест-системе для выявления генома герпесвируса сибирского осетра
3.3.8 Молекулярно-генетическая характеристика изолятов вируса
3.3.9 Мониторинговые исследования осетроводных хозяйств на наличие герпесвируса сибирского осетра
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ
5. ВЫВОДЫ
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ

эволюцию вирусов, с помощью пакета прикладных компьютерных программ PHYLIP; CLUSTALW; PAUP; MEGA позволяющих анализировать большие массивы данных и получать результаты, недостижимые при использовании прежних методов исследования.
По сравнению с герпесвирусами млекопитающих и птиц, которые делятся на три чётких подсемейства Alphaherpesvirinae, Betaherpesvirinae и Gammaherpesvirinae семейства Herpesviridae, герпесвирусы низших позвоночных и беспозвоночных обладают значительными различиями в структуре генома с едва сопоставимыми генами и последовательностями.
Геном не всех членов семейства Alloherpesviridae хорошо изучен. Полная последовательность гена ДНК-зависимой ДНК-полимеразы -одного из наиболее хорошо изученных генов герпесвирусов -определена только для четырех членов этого семейства: герпесвирус икталуровых 1 типа [50], герпесвирус карповых 3 типа [67, 85, 103] и оба герпесвируса лягушек [26, 53]. Для герпесвируса лососевых 1 типа [51, 84] и 2 типа [169], угревых 1 типа [56], карповых 2 типа [70] и осетровых 1 и 2 типов [66, 106] последовательность этого гена пока определена лишь частично [120].
Частично определена последовательность гена терминазы [106] для герпесвирусов осетровых обоих типов, икталуровых 1 типа, лягушек 1 типа и карповых 3 типа, которая отвечает за упаковку геномной ДНК в капсид.
Проведенный анализ нуклеотидной последовательности генов ДНК-полимеразы и терминазы семи герпесвирусных изолятов, выделенных от североамериканских осетров (белого и тупорылого), показал, что они формируют две геногруппы из пяти, установленных для герпесвирусов рыб и амфибий (рисунок 5) [106].