Антитела к "узлу" ковалентной связи между белком VPg и РНК пикорнавирусов

• Автор: Гаврюшина, Елена Сергеевна
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 106 с. : ил.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
1. КОВАЛЕНТНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ БЕЛКОВ И РНК У
РНК-СОДЕРЖАЩИХ ВИРУСОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
1.1. Пикорна-подобные вирусы
1.1.1. Пикорнавирусы
1.1.2. Калицивирусы
1.1.3. Потивирусы
1.1.4. Комовирусы
1.2. Собемо-подобные вирусы
1.3. Бириавирусы
1.4. Консервативность структуры вирусных ковалентных комплексов РНКи механизма инициации репликации вирусных геномов
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Синтез антигена и получение антисывороток
2.1.1. Твердофазный синтез модельного соединения [А(Ас),СО(ЫНМе)]Туг-(5’Р->0)ир-0-(СН2)бШ2
2.1.2. Синтез модельного соединения [Л^Ас^СО^НМе^ТугДЗ’Р—Ю)11р-0-(СН2)бМН2 в растворе
2.1.3. Обработка модельного соединения [А(Ас),СО(№1Ме)]Туг-(5’Р—Ю)ир-0-(СН2)б>Ш2 фосфодиэстеразой
2.1.4. Синтез антигена — конъюгата модельного соединения с лизоцимом
2.1.5. Синтез аналита - конъюгата модельного соединения с БСА
2.1.6. Иммунизация кроликов и получение антисывороток
2.2. Получение препаратов иммуноглобулинов к модельному соединению
2.2.1. Сульфат-аммонийное фракционирование антисывороток

2.2.2. Ионообменная хроматография на ИЕАЕ-Тоуореаг1 650М
2.2.3. Хроматография антител на протеин О сефарозе
2.2.4. Очистка препаратов иммуноглобулинов к модельному соединению от примесной РНКазной активности
2.2.4.1. Хроматография на протеин А сефарозе
2.2.4.2. Гель-фильтрация на сефадексе 0-100
2.2.4.3. Г ель-фильтрация антител на сефакриле Б-200
2.2.4.4. Проверка препаратов антител на наличие примесной нуклеазной активности
2.3. Аффинная очистка антител к «узлу связи»
2.3.1. Синтез аффинного сорбента с ро1у(Ц)
2.3.1.1. Гидролиз ро1у(и) нуклеазой Б1
2.3.1.2. Окисление ро1у(11) перйодатом натрия
2.3.1.3. Синтез конъюгата В8А-ро1у(11) по Эрлангеру и Байзеру
2.3.1.4. Синтез ро1у(и)-БСА-сеф)арозы
2.3.2. Очистка антител на ро1у(Г1)-БСА-сефарозе
2.3.3. Синтез аффинного сорбента с модельным соединением [А(Ас),СО(ННМе)]Туг-(5’Р-^0)ир-0-(СН2)бИН2
2.3.4. Очистка антител на сорбенте с модельным соединением [Аг(Ас),СО(ЫНМе)]Туг-(5’Р—>0)иР-0-(СН2)бКН2
2.4. Характеристика препаратов антител на разных стадиях очистки методом «иммунозолото»
2.4.1. Анализ узнавания РНК и белков препаратами антител методом иммунодота
2.4.2. Анализ взаимодействия препаратов антител с гидролизованными РНК методом иммунодота
2.4.3. Анализ узнавания РНК препаратами антител методом иммуноблота
2.5. Исследование пикорнавирусной инфекции в клетках НеЬа с помощью препарата антител к «узлу связи»
2.5.1. Культивирование клеток НеЬа в монослое
2.5.2. Заражение клеток НеЬа вирусом обыкновенной простуды человека 2 для получения вирусного инокулята
2.5.3. Титрование препаратов вируса обыкновенной простуды человека 2
2.5.4. Подготовка предметных стекол с монослоем клеток НеЬа

2.5.5. Одноцикловое заражение клеток HeLa HRV2 и фиксация клеток
2.5.6. Фиксация клеток метанолом
2.5.7. Фиксация клеток формальдегидом
2.5.8. Исследование пикорнавирусной инфекции в клетках HeLa методом иммунофлуоресцентной микроскопии
2.6. Получение ДНК-зондов для детекции пикорнавируспых РНК in vitro и in vivo
2.6.1. Характеристика плазмид
2.6.2. Синтез зондов ДНК-(диен)платина
2.6.3. Проверка системы детекции
2.6.3.1.Проверка узнавания антител к ДНК-(диен)платине вторичными антителами
2.6.3.2. Проверка специфичности антител к ДНК-зонду методом иммуноферментного анализа (ИФА)
2.6.3.3. Проверка специфичности антител к ДНК-зонду методом «иммунозолото»
2.6.4. Получение препаратов неинфицированных и инфицированных клеток Кребс II и HeLa
2.6.4.1. Культивирование клеток Кребс II и HeLa
2.6.4.2. Получение вирусных инокулятов
2.6.4.3. Одноцикловое заражение клеток асцитной карциномы Кребс II вирусом Менго
2.6.4.4. Одноцикловое заражение клеток I-IeLa вирусом обыкновенной простуды человека 2
2.6.5. Получение препаратов суммарной РНК неинфицированных и инфицированных клеток Кребс II и HeLa
2.6.5.1. Выделение суммарной РНК клеток Кребс II с помощью НТХА на микроколонках
2.6.5.2. Получение препарата суммарной РНК клеток Кребс II и HeLa фенольным методом
2.6.5.3. Выделение суммарной РНК клеток Кребс II и HeLa с помощью НТХА без микроколонок
2.6.5.4. Спектрофотометрическая и электрофоретическая характеристика препаратов суммарной РНК

2.6.2. Синтез зондов ДНК-(диен)платпна
Для получения ДНК-зондов плазмиды РМ1602 и рНЮ/2 были химически мечены хлордиэтилентриаминоплатиной хлористой (сокращенно - (диен)платиной, рис. 13) при соотношении атомов платины и нуклеотидов 1:10.

сн2 - сн2 - ын - сн2 - сн2 I I I
ЫН2 Р1 ЫНг С1

Рис. 13. Структурная формула хлордиэтилеитриаминоплатины хлористой.
Для приготовления зондов использовали рекомбинантные плазмиды РМ1602 В1исзспр1 Stratagene БКП, любезно предоставленную А. Ра1шепЬег§. Эта плазмида содержит вставку кДНК вируса Менго. Плазмида была охарактеризована спектрофотометрически и электрофоретически. Она имеет выраженный нуклеиновый спектр, соотношение А26()/А28оравно 2,045.
К 17 мкл водного раствора, содержащего 2 мкг плазмиды, добавляли 2 мкл 100 мМ ИаСЮ.}. Плазмиду денатурировали 5 мин при 100°С (на кипящей водяной бане) и быстро охлаждали до 0°С, затем добавляли 1 мкл 10'3М [Р1(<Неп)С1]С1, перемешивали и инкубировали 1 ч при 65°С. Дополнительной очистки зондов от (диен)платины не проводили. Конечная концентрация зонда составляла 100 мкг/мл. Полученные зонды хранили при -20°С.
2.6.3. Проверка системы детекции
2.6.3.1.Проверка узнавания антител к ДНК-(диен)платине вторичными антителами
Специфичность антител к ДНК-зонду проверяли методами иммуноферментного анализа (ИФА) и «иммунозолото».
Сначала проверяли способность козьих антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, взаимодействовать с хемилюминесцентным субстратом. Для этого делали разведения препарата антител в 400, 1600, 8000, 40000 и 200000 раз, наносили их в точку по 1 мкл на нитратцеллюлозную мембрану ВА-85 (8сЫе1сЬег&8с1ше11, Германия, диаметр пор 0,45 мкм) и, не высушивая, инкубировали 3 мин на свету с хемилюминесцентным субстратом, удаляли избыток субстрата и экспонировали мембраны с рентгеновской пленкой.
Затем проверяли чувствительность детекции антител кролика (первичных антител) к ДНК-(диен)платине вторичными коммерчески доступными козьими антителами к