Гликозаминогликан-связывающие варианты вируса клещевого энцефалита

• Автор: Козловская, Любовь Игоревна
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 151 с. : ил.

Оглавление
Оглавление

Список сокращений

Введение

Обзор литературы

I. Краткая характеристика рода Flavivirus

1. Таксономическое положение рассматриваемых вирусов

2. Краткая молекулярно-биологическая характеристика

II. Белок Е

1. Структура белка Е

2. Изменение конформации белка Е при низком значении pH

3. Проникновение вирионов в клетку
III. Рецепторные молекулы для представителей рода Flavivirus
1. Молекулы, клеточной адгезии (cell adhesion molecules, CAMs)
2. Высокоаффинный ламинин-связывающий белок (ВЛБ)
3. Другие молекулы клеточношповерхности как возможные рецепторы для представителей рода Flavivirus
IV. Гликозаминогликаны (ГАГ)
1. Краткая характеристика
2. Стратегии вирусов по использованию гликозаминогликанов клетки
3. Взаимодействие представителей рода Flavivirus с ГАГ
4. Получение и свойства ГАГ-связывающих вариантов Материалы и методы
Использованные в работе вирусы
Культура клеток
Животные
Иммунные сыворотки
Олигонуклеотиды
Заражение культуры клеток
Титрование инфекционного вируса методом бляшек под агаровым покрытием
Окраска бляшек под агаровым покрытием с номощыо генциан виолета
Титрование вируса на мышах
Клонирование вируса методом бляшек
Концентрирование ВКЭ из культуральной жидкости инфицированных клеток.
Гемагглютинация (ГА)
Чувствительность ГА к действию детергентов
Ракетный иммуноэлектрофорез
Сорбция вируса на гепарин-сефарозе
Выделение РНК
Обратная транскрипция
Полимеразная цепная реакция
Аналитический электрофорез ДНК в агарозном геле

Препаративный электрофорез и выделение продукта ПЦР из легкоплавкой агарозы
Определение нуклеотидной последовательности
Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей
Моделирование белковых структур
Моделирование молекулярной динамики (МД)
Метод построения и оценки корреляционных карт движений элементов вторичной
структуры эктодомена белка Е
Результаты
I. Варианты с ГАГ-связывающим фенотипом в природной популяции ВКЭ
1.Описание свойств коллекционных штаммов ВКЭ

2. Моделирование и анализ молекулярной динамики белка Е для штаммов
СофьинКГГ и 80к, а также клона 18А штамма Абсеттаров
II. Изучение влияния структуры белка Е на свойства вариантов одного штамма ВКЭ.
1. Выбор модели для исследования
2. Сорбция вирионов вариантов штамма ЭК-328 ВКЭ на гепарин-сефарозе
3. Моделирование и анализ молекулярной динамики белка Е для вариантов штамма ЭК-328 ВКЭ
4. Температурная устойчивость вирионов вариантов штамма ЭК-328 ВКЭ
5. ГА вариантов штамма ЭК-328 ВКЭ и её устойчивость к детергентам
Обсуждение
1. Существование вариантов с различной аффинностью к ГАГ в природной популяции ВКЭ
2. Корреляционной карты движений димера поверхностного белка вириона Е ВКЭ и разработка подхода к её оценке
3. Мутации, приводящие к повышению заряда белка Е ВКЭ, и ГАГ-связывающий фенотип
4. Изучение влияния структуры эктодомена белка Е на свойства вариантов штамма ВКЭ
5. Анализ молекулярной динамики белка Е ВКЭ для вирусов, принадлежащих к различным подтипам
Выводы
Благодарности
Список литературы

Список сокращений
Общие:
а.к. - аминокислота(-ы); б/п — беспородные;
БОЕ - бляшкообразующая единица; в/м - внутримышечно;
ВА - вирионный антиген;
ВЛБ - высокоаффинный ламинин-связывающий белок; ГА - гемагглютинирующая активность;
ГАГ(и) - гликозаминогликан(-ы);
ГС - гепарин-сефароза;
ГС-ГАГ - гепарансульфат гликозаминогликаны;
ГТФ - гуанозинтрифосфат;
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота; дНТФ - дезоксинуклеотидтрифосфат; и/п - интраперитонеально; и/ц - интрацеребрально;
ИФА - иммуноферментный анализ;
КЖ - культуральная жидкость;
КЭ - клещевой энцефалит;
ЛД50 - 50% летальная доза;
МС - мозговая суспензия;
НА - невирионный антиген; нт - нуклеотид(-ы);
НТО - нетранслируемая область;
ОРС - открытая рамка считывания;
ОТ - обратная транскрипция; п/к - подкожно;
ПААТ - полиакриламидный гель;
ПЦР — полимеразная цепная реакция;

Последовательность гена avp3 интегрина высоко консервативная, что говорит о возможности использования широкого круга хозяев. Отсюда можно сделать вывод, что для вирусов Западного Нила и Японского энцефалита ауРз интегрин является общей рецепторной молекулой в клетках позвоночных (Chu and Ng, 2004b).
Связывание физиологических лигандов с интегринами запускает ассоциированные с ними сигнальные пути. Для WNV было показано, что взаимодействие avp3 интегрина с вирионами приводит к активации FAK (focal adhesion kinase, киназа фокальной адгезии) путём автофосфорилирования. Из этого можно сделать вывод об активации сигнального пути, ассоциированного с av[33 интегрином, при его связывании с вирионами вируса Западного Нила. Возможно, сигнальный путь с активацией FAK ведёт к сборке актиновых фибрилл, необходимых для клатрин-опосредованного эндоцитоза WNV (Chu and Ng, 2004b).
Была исследована зависимость проникновения WNV в клетки от RGD-последовательности в белке Е при ингибировании RGD-содержащими пептидами. Было показано, что они лишь частично блокируют взаимодействие вируса с клетками (Chu and Ng, 2004b). Это указывает на то, что наличие RGD/RGE-мотива не является критическим при связывании с интегрином.
Для патогенных хантавирусов, вирусов New York-1 и Hantaan, было показано взаимодействие с плексин-семафориновым (PSI) доменом ауРз интегрина, а не с RGD-связывающим сайтом, при проникновении вируса в клетку. Это происходит в присутствии ионов Мп2+ при изменении конформации интегрина с активной на неактивную (Raymond et al., 2005). Поэтому можно предполагать взаимодействие с интегринами, независимое от RGD-последовательности, и при проникновении флавивирусов.
Из всего выше сказанного можно сделать вывод, что интегрины являются одной из рецепторных молекул для флавивирусов на клетках млекопитающих, а, возможно, и членистоногих.