Идентификация вируса болезни Акабане на основе методов анализа генома

• Автор: Хан, Евгения Олеговна
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Покров
• Количество страниц: 86 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений
1 ВВЕДЕНИЕ
1.1 Актуальность темы
1.2 Степень разработанности проблемы
1.3 Цель и задачи исследования
1.4 Научная новизна работы
1.5 Теоретическая и практическая значимость работы
1.6 Соответствие диссертации паспорту научной специальности
1.7 Публикации результатов
1.8 Степень достоверности и апробация работы
1.9 Структура и объем диссертационной работы
1.10 Основные положения диссертации, выносимые на защиту
1.11 Личный вклад автора в выполнение работы
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1 Общая характеристика семейства Випуаутёае
2.2 Распространение и пути передачи вируса болезни Акабане
2.3 Характеристика возбудителя болезни Акабане
2.3.1 Этиология болезни Акабане
2.3.2 Структура и физико - химические свойства вируса болезни Акабане.
2.3.3 Структура генома и особенности репликации вируса болезни
Акабане
2.3.4 Изучение нуклеотидного состава и филогенетический анализ
буньявирусов и вируса болезни Акабане
2.4 Диагностика болезни Акабане
2.4.1 Клинико-эпизоотологческая диагностика
2.4.2 Выделение вируса болезни Акабане
2.4.3 Серологические методы диагностики
2.4.4 Полимеразная цепная реакция

2.5 Заключение по обзору литературы
3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1 Материалы
3.1.1 Вирусы
3.1.2 Животные
3.1.3 Плазмиды и бактериальные штаммы
3.1.4 Культуры клеток
3.1.5 Реактивы
3.1.6 Лабораторное оборудование
3.2 Методы
3.2.1 Культивирование клеток
3.2.2 Заражение животных
3.2.3 Выделение РНК
3.2.4 Синтез кДНК
3.2.5 Постановка полимеразной цепной реакции
3.2.6 Анализ продуктов ПЦР
3.2.7 Выделение и очистка продуктов ПЦР
3.2.8 Нуклеотидное секвенирование
3.2.9 Клонирование фрагментов генов
3.2.10 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
3.2.11 Статистическая обработка полученных результатов
3.3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.3.1 Изучение репродукции вируса болезни Акабане в перевиваемой
культуре клеток УЕЛО
3.3.2 Разработка тест-системы для выявления генома вируса болезни
Акабане методом ОТ - ПЦР с электрофоретической детекцией
3.3.3 Разработка тест-системы для выявления генома вируса болезни
Акабане методом ОТ - ПЦР в реальном времени
3.3.4 Выявление генома вируса болезни Акабане в пробах крови от
экспериментально зараженных овец и морских свинок и в пробах

мозга инфицированных мышей-сосунков
3.3.5 Секвенирование нуклеотидных последовательностей и филогенетический анализ вируса болезни Акабане, депонированного в музее ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии
4 ОБСУЖДЕНИЕ
5 ВЫВОДЫ
6 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
7 СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
8 ПРИЛОЖЕНИЕ

3.1.5 Реактивы
Додецил сульфат натрия (Koch-Lightlaboratories), хлорид калия (Реахим), ЭДТА, магния хлорид, магния сульфат, дитиотрейтол (Хеликон), натрий хлористый, натрия карбонат, натрия иодид, натрия ацетат, натрия цитрат, твин-20, тритон Х-100 (Serva, Германия), глицерин (MERCK), деионизированная вода (удельное сопротивление более 10 Мом), бакто-пептон, дрожжевой экстракт, агароза, 5х реакционный буфер Ампли Сенс blue (Интерлабсервис, г. Москва), 5х реакционный ПЦР буфер (Fermentas, Латвия), смесь нуклеозидтрифосфатов ЮОмМ (Fermentas, Латвия), специфические олигонуклеотиды и флуоресцентные зонды (Литех, г.Москва), Taq-ДНК-полимераза (5 ед./мкл), «Big Dye terminator v.3.1 ready reaction sequencing kit» (Applied Biosystems, США), полимер POP 7 (Applied Biosystems, США), этиловый спирт.
Все реактивы имели квалификацию не ниже Х.Ч. или О.С.Ч.
3.1.6 Лабораторное оборудование
В работе использовали следующее лабораторное оборудование:
• микроцентрифуга «Eppendorf» на 14000 об/мин для пробирок объемом
1,5 мл и 0,5 мл «Axygen»;
• автоматические пипеточные дозаторы на 10 мкл, 20 мкл, 100 мкл и 1000 мкл и многоканальные автоматические пипетки (Ленпипет, Eppendorf);
ДНК-амплификатор «Терцик MC - 2» (Россия);
• термоциклер «Palm Cycler» (Corbett Research, Австралия);
• амплификатор для ПЦР в режиме реального времени «IQ-5» (Bio-Rad, США) и «Rotor-Gene 6000» (Corbett Research, Австралия);
• вортекс (Biosan, Латвия);
• твердотельный термостат (Biosan, Латвия);
• медицинский вакуумный отсасыватель (ОМ-1, Россия);
• электрофорез проводили с использованием системы для электрофоретического разделения белков и нуклеиновых кислот,