Особенности антигенной структуры гемагглютинина, распознаваемые антителами против современных вирусов гриппа A подтипов H5 и H1

• Автор: Игнатьева, Анна Викторовна
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 166 с. : ил.

Содержание
Список сокращений
Введение
Актуальность темы
Цель и задачи исследования
Научная новизна и практическое значение работы
Основные положения, выносимые на защиту
Часть 1. Обзор литературы
Глава 1. Общая характеристика вируса гриппа А
Глава 2. Характеристика генома вируса гриппа А
2.1. РНК-сегменты 1, 2
2.2. РНК-сегмент4
2.3. РНК-сегмент
2.4. РНК-сегмент
2.5. РНК-сегмент
2.6. РНК-сегмент
Глава 3. Антигенная структура молекулы гемагглютинина (НА) вируса гриппа А
Глава 4. Антигенная вариабельность вируса гриппа А в природе
4.1. Механизм антигенного дрейфа
4.2. Реассортация как механизм антигенного шифта
Глава 5. Влияние структурных изменений НА вируса гриппа А на его функциональные
свойства
Глава 6. Вирусы гриппа А подтипа Н5Ш, вызывающие эпизоотию у птиц и спорадические случаи заболевания человека
Часть 2 Собственные исследования
Глава 1. Материалы и методы
1.1 Вирусы
1.2 Антитела
1.3 Титрование инфекционности вирусов на куриных эмбрионах
1.4 Реакция гемагглютинации (РГА)
1.5 Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)
1.6 Селекция эскейп-мутантов
1.7 Получение реассортантов методом скрещивания и селекции

Очистка и концентрация вирусов
1.9 Определение рецептор-связывающей активности вируса гриппа А
1.10 Элюция вируса с куриных эритроцитов
1.11 Иммунизация животных
1.12 Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ)
1.13 Количественное определение вирусных белков
1.14 Твердофазный иммуноферментный анализ (ТФИФА)
1.15 Автоматическое секвенирование
1.16. Статистическая обработка результатов
1.17. Построение трехмерной модели НА,
Глава 2. Результаты
2.1. Локализация и структура антигенных эпитопов НА, распознаваемых
моноклональными антителами (МКАТ) к вирусу гриппа А/Оиск/ЛоуозіЬігзк/Зб/ОЗ (Н5№)
2.1.1. РТГА со штаммами вируса гриппа подтипа Н5
2.1.2. Предварительная характеристика панели МКАТ в перекрестной РТГА с ранее полученными эскейп-мутантами
2.1.3. Селекция эскейп-мутантов МКАТ против вируса А/Оиск/По уо я і Ы гя к/5 6/0 5 (Н5Ш) и их антигенная характеристика в перекрестной РТГА с МКАТ
2.1.4. Характеристика эскейп-мутантов по данным РТГА с МКАТ против вируса А/УіеШат/1203/04 (Н51П)
2.1.5. Секвенирование НА селекционированных эскейп-мутантов
2.1.6. Картирование антигенных сайтов в трехмерной структуре НА подтипа Н5.„
2.2. Получение реассортантов, содержащих НА пандемического вируса гриппа
(НІШ) 2009 года
2.2.1. Получение и генотипирование реассортантов
2.2.2. Определение уровня репродукции реассортантов и вирусов-родителей в куриных эмбрионах
2.3. Антигенные эпитопы, распознаваемые МКАТ к НА пандемического вируса
гриппа (НІШ) 2009 года
2.3.1. Реакция МКАТ против вируса 2009 года с разными штаммами вируса гриппа подтипа Н1
2.3.2. Селекция и антигенная характеристика эскейп-мутантов
2.3.3. Секвенирование НА эскейп-мутантов первого поколения
2.3.4. Селекция и антигенная характеристика эскейп-мутантов второго поколения

2.3.5. Секвенирование НА эскейп-мутантов второго поколения
2.3.6. Антигенная характеристика эскейп-мутантов первого и второго поколения подтипа НШ1 посредством ТФИФА
2.3.7. Локализация аминокислотных позиций, распознаваемых МКАТ к пандемическому вирусу 2009 г., в трехмерной структуре НА
2.4 Определение рецептор-связывающей активности эскейп-мутантов вирусов
гриппа А подтипов Н1 и Н5 с сиало-олигосахаридами
2.4.1. Определение рецептор-связывающей активности эскейп-мутанов подтипа Н5
2.4.2. Определение рецептор-связывающей активности эскейп-мутантов подтипа Н1
2.4.3. Элюция вируса дикого типа и мутантов с куриных эритроцитов
2.5. Поиск аминокислотных замен, выявленных у эскейп-мутантов, среди
циркулирующих изолятов Н51Ч1 и Н1N1
2.5.1. Присутствие аминокислотных замен, выявленных у эскейп-мутантов подтипа Н1, среди изолятов пандемического вируса подтипа НШ1
2.5.2. Присутствие аминокислотных замен, выявленных у эскейп-мутантов подтипа Н5 среди изолятов подтипа Н5141, выделенных от птиц
Часть 3. Обсуждение
Выводы
Список литературы
Благодарности
Приложения

Глава 4. Антигенная вариабельность вируса гриппа А в природе
В основе эволюции вирусов лежат разные механизмы изменения генома. Мутации, включая замены, делеции и вставки, и реассортация РНК-сегментов генома являются наиболее важными факторами, обеспечивающими вариабельность вирусов гриппа. Менее ясна роль других механизмов, таких как образование дефектных частиц [199] и межмолекулярная рекомбинация. Хотя у негативно-нитевых вирусов рекомбинация является достаточно редким событием, был продемонстрирован пример включения в ген НА последовательности клеточной мРНК, что обеспечило способность вируса к многоцикловой инфекции в клеточной культуре без трипсина, что обычно коррелирует с высокой вирулентностью [117]. Не исключено, что такие явления также могут быть фактором быстрых эволюционных изменений.
4.1. Механизм антигенного дрейфа
НА и ИА вируса гриппа являются особенно вариабельными поверхностными гликопротеинами вириона. В настоящее время идентифицировано 16 антигенных подтипов НА (Н1-Н16) и 9 подтипов ИА (ТМ1-К9) [26, 70]. Характер антигенной вариабельности НА и ИА резко отличается при циркуляции среди людей. У птиц, в связи с малым сроком их жизни и постоянным притоком в популяцию особей, не имеющих иммунитета, вариация имеет не последовательный, а дивергентный характер. У вирусов гриппа А человека имеют место два типа антигенной вариабельности - антигенный дрейф и антигенный шифт (сдвиг). Антигенный дрейф происходит в пределах одного подтипа, заключается в серии изменений (главным образом, точечных мутаций) на уровне гена и приводит к возникновению штаммов, мало отличающихся от вируса-предшественника. У вирусов гриппа лошадей и свиней дрейф выражен очень слабо. Антигенный сдвиг (шифт) заключается в серии перегруппировок генов между штаммами вируса гриппа А человека, других млекопитающих и