Новый вирусный вектор на основе генома потексвируса для экспрессии целевых белков в растениях

• Автор: Путляев, Егор Валерьевич
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 145 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Общая характеристика рода РЫехУниз
1.1 Структура генома
1.2 Вирусные белки, кодируемые геномом потексвирусов
2. Вирус мозаики альтернантеры
2.1 Структура генома ВМАльт
2.2 Белки, кодируемые геномом ВМАльт
3. Создание векторов на основе геномов представителей рода РоГехуігих
3.1 Полноразмерные вирусные векторы, полученные на основе генома ХВК.
3.2 Деконструированные вирусные векторы на основе генома ХВК
3.3 Векторы на основе генома вируса мозаики альтернантеры (ВМАльт)
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
2. Подбор праймеров для ПЦР
3. Рестрикция ДНК
4. Лигирование фрагментов ДНК
5. Трансформация бактериальных клеток
6. Выделение плазмидной ДНК
7. Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот в агарозном геле
8. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля
9. Выделение тотальной РНК из листьев растений ИісоИапа ЬеШкатіапа
10. Получение кДНК-копий субгеномных РНК, образуемых векторами
11. Получение кДНК-копии фрагмента кодирующей последо-вательности гемагглютинина вируса гриппа А

12. Получение бинарного вектора p(AItMV-single)
13. Получение бинарного вектора p(AltMV-double)
14. Получение бинарного вектора p(AltMV-triple)
15. Схема получения бинарного вектора p(AltMV-double*)
16. Схема получения бинарного вектора p(AltMV-double-MCS)
17. Схема получения бинарного вектора p(AltMV-double-GFP)
18. Схема получения вектора pQE-HARBD
19. Схема получения бинарного вектора p(AltMV-double-HARBD)
20. Схема получения бинарного вектора p(AltMV-double-hGCSF)
21. Схема получения вектора pQE-hGCSF
22. Электрофоретический анализ белков в денатурирующем полиакриламидном геле
23. Вестерн-блот
24. Агроинфильтрация листьев Nicotiana benthamiana
25. Анализ накопления целевых белков в листьях N. benthamiana
26. Получение вирусоподобных частиц из БО вируса мозаики альтернантеры, экспрессированного вирусными векторами в листьях N. benthamiana
27. Выделение целевых белков из листьев растения N. benthamiana
28. Экспрессия и выделение рекомбинантных белков из клеток Е. coli
29. Электронная микроскопия:
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Создание векторов с одним и двумя последовательно расположенными субгеномными промоторами, контролирующими экспрессию гена целевого белка
2. Исследование транскрипционной активности субгеномных промоторов в составе вектора AltMV-double
3. Исследование вирусоподобных частиц, образующихся из БО ВМАльт при экспрессии вектора AltMV-double в листьях N. benthamiana
4. Экспрессия целевых белков различной природы в растениях N. benthamiana с помощью вектора AltMV-double

5. Изучение влияния введения дополнительного третьего СГП на
эффективность вектора AltMV-double
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ

структуры ТБ2 ВМБ показало, что молекула дважды пронизывает мембрану ЭПР, формируя U-образную структуру, при этом N- и С-концы молекулы находятся в цитоплазме (Hsu et ah, 2008; Mitra et al., 2003; Lee et al., 2010). С-конец молекулы ТБ2 имеет положительный заряд, кроме того, методом мутагенеза в его составе были выявлены два консервативных остатка цистеина Cysl09 и Cysll2, замена каждого из которых приводила к остановке распостранения ВМБ между клетками (Hsu et ah, 2008; Tseng et ah, 2009).
ТБ2 XBK способен формировать ассоциированные с мембранами ЭПР гранулы, содержащие также ТБЗ - т.н. ТБ2/3 гранулы (Krishnamurthy et ah, 2003; Ju et ah, 2005; Samuels et ah, 2007). При этом ТБ2 XBK, экспрессированный отдельно от остальных компонентов вируса, индуцирует образование в цитоплазме исследуемых клеток растения мелких гранулярных везикул (Ju et ah, 2005), содержащих в своем составе мембрану ЭПР. В экспериментах in vivo показано, что в клетках, инфицированных ХВК и экспрессирующих дополнительно флуоресцентно-меченный ТБ2, ТБ2 компактно локализуется в цитоплазме в районах входов в каналы плазмодесм (Tilsner et ah, 2013).
ТБЗ Белок, кодируемый третьим геном тройного блока (ТБЗ) наравне с ТБ2 является небольшим трансмембранным белком (молекулярная масса - 8 кДа для ХВК и ВМБ). ТБЗ имеет один трансмембранный домен (Krishnamurthy et ah, 2003), расположенный на N-конце белка, в то время как на его С-конце располагается последовательность, обеспечивающая олигомеризацию белка и локализации ТБЗ на поверхности тубул кортикального ЭПР (Wu et ah, 2011). Эта сигнальная последовательность достаточно консервативна среди потексвирусов и изменения в ней имеют негативное влияние на импорт в соседние клетки транспортной формы вируса (Wu et ah, 2011). Интеграция данного белка в мембрану ЭПР также необходима для нормального межклеточного транспорта ХВК (Krishnamurthy et ah, 2003).
ТБЗ входит в состав белковых гранул, ассоциированных с поверхностью мембран ЭПР, образование которых инициирует ТБ2. При этом ТБЗ также обнаруживается in vivo в составе мелких периферических гранул, расположенных