Транскрипционные стратегии phiEco32-подобных бактериофагов

• Автор: Лавыш, Дарья Геннадиевна
• Шифр специальности: 03.01.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 105 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Общая характеристика работы
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Транскрипция прокариот
1.1.1 Структурно-функциональные особенности бактериальной
РНК-полимеразы
1Л .2 Механизмы взаимодействия РНК-полимеразы с промоторами
1.2 Классификация ст-факторов прокариот
1.2.1 Семейство а70-факторов
1.2.2 Группа 2 ст70-факторов
Подгруппа ст-факторов стационарной фазы
Подгруппа о-факторов цианобактерий
Подгруппа о-факторов грамположительных бактерий с высоким G+C составом
1.2.3 Подгруппа альтернативных о70-факторов
Подгруппа ст-факторов, участвующих в морфогенезе
флагеллы
Подгруппа о-факторов внеклеточной функциональности
Подгруппа о-факторов, участвующих в споруляции
Подгруппа о-факторов теплового шока
1.2.4 Семейство о54-факторов
1.3 Транскрипция бактериофагов
1.3.1 Сигма факторы бактериофагов и их промоторы
1.3.2 Транскрипционная стратегия бактериофага Bacillus subtilis SPOl
1.3.3 Транскрипционная стратегия бактериофага Escherichia coli Т
1.3.4 Транскрипционная стратегия бактериофага Bacillus anthracis Fah
1.3.5 Транскрипционная стратегия бактериофага Escherichia coli phiEco
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Определение активности о70-зависимых промоторов в ходе инфекции бактериофагом phiEco
3.2 Изучение регуляции активности средних и поздних gp36-зависимых промоторов бактериофага phiEco
3.3 Общая схема регуляции транскрипции генов в ходе инфекции бактериофагом phiEco
3.4 Морфологическое сравнение фагов phiEco32 и
3.5 Сравнение организации геномов бактериофагов phiEco

3.6 Сравнение всех рЫЕсо32-подобных бактериофагов
3.7 Биоинформатический анализ транскрипционных стратегийрЫЕсо32-подобных бактериофагов
3.8 Отработка условий инфекции штамма Salmonella enterica серовар Newport бактериофагом
3.9 Предсказание оперонной организации поздних и средних генов бактериофага
3.10 Идентификация поздних промоторов бактериофага
3.11 Определение консенсусной последовательности позднего промотора фага
3.12 Продукт гена g47 является о-фактором бактериофага 7-11.
3.13 Определение области плавления gp47-npoMOTopa
3.14 Определение аффинности gp47 к РНК-полимеразе
3.15 Идентификация а70-промоторов фага
3.16 Поиск дополнительных транскрипционных факторов, закодированных в геноме бактериофага
3.17 Влияние белка gp98 бактериофага 7-11 на транскрипцию
3.18 Общая схема регуляции транскрипции генов в ходе инфекции бактериофагом 7-11 и предположения о регуляции транскрипции бактериофага GAP
4. ВЫВОДЫ
5. СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
6. СПСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫЙ АВТОРОМ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
7. БЛАГОДАРНОСТИ

Общая характеристика работы
Актуальность работы. Бактериофаги удивительно разнообразны в использовании различных механизмов и стратегий регуляции транскрипции своих генов в процессе инфекции бактериальной клетки. Регуляция экспрессии генов позволяет достичь высокого уровня выхода фаговых частиц. В развитии литических бактериофагов чаще всего выделяют 3 стадии инфекции: раннюю, среднюю и позднюю. На ранней стадии, как правило, происходит синтез фаговых белков, функция которых заключается в переключении системы транскрипции клетки-хозяина с экспрессии генов бактерии на экспрессию генов фага. Белки, необходимые для репликации фагового генома, синтезируются на средней стадии. На поздней стадии экспрессируются гены, кодирующие белки оболочки, упаковки ДНК и лизиса клеток.
Контроль экспрессии генов бактериофага осуществляется с помощью закодированных в геноме бактериофага разнообразных транскрипционных факторов, и/или собственной РНК-полимеразы и различия в последовательности промоторов генов разных временных классов. Транскрипционные факторы могут выполнять следующие функции: ковалентно модифицировать РНК-полимеразу клетки-хозяина, способствовать конформационным изменениям РНК-полимеразы, участвовать в распознавании промоторной области генов. На сегодняшний день существуют группы фагов, транскрипционная стратегия для которых хорошо изучена. К ним относится бактериофаг Т7, который кодирует свою собственную односубъединичную РНК-полимеразу, экспрессирующую средние и поздние гены во время инфекции. Другую стратегию используют Т4-подобные фаги, у которых транскрипция ранних генов осуществляется о70-холоферментом РНК-полимеразы и при этом синтезируются белки, изменяющие промоторную специфичность а70-субъединицы. Комплекс РНК-полимеразы с таким фактором начинает работать только на промоторах средних генов.
На средней стадии синтезируется собственный о-фактор, который при участии дополнительных фаговых белков обеспечивает узнавание поздних промоторов. Третья стратегия характерна для бактериофага лямбда. Этот фаг на всех стадиях использует а70-холофермент РНК-полимеразы клетки хозяина. Гены, принадлежащие к одному временному классу, кластеризованы и отделены друг от друга терминаторами, на которых происходит остановка транскрипции. На каждой предыдущей стадии синтезируются белки-антитерминаторы, позволяющие РНК-полимеразы не останавливаться на терминаторе и перейти к транскрипции генов следующей группы.

Бактериофаг Т4 является представителем группы Т4-подобных фагов. Бактериофаги этой группы заражают клетки E. coli. По морфологической классификации Т4 относится к группе Myoviridae. Геном бактериофага Т4 представлен линейной двухцепочечной ДНК длинной 168903 пн. У фагов всех представителей филогенетической группы Т4 ДНК вместо цитозина содержит гидроксиметилированный дезоксицитозин (НМС) (Mosig et al., 2006). Такая модификация не только защищает ДНК от деградации и действия нуклеаз бактерии, но и делает структуру ДНК отличной от В-формы и очень стабильной (Mosig et al., 2006). Геном представлен в основном А-Т богатыми участками, на которых ДНК-полимераза и РНКП работают значительно быстрее, чем на сбалансированной А-Т последовательности (Miller et al, 2003).
У бактериофага Т4 выделяют три класса генов: ранние, средние и поздние. Экспрессия генов бактериофага Т4 на каждом этапе зависит от транскрипционного аппарата клетки-хозяина. Временная регуляция транскрипции генов бактериофага основывается на существовании разных классов промоторов, отличающихся консенсусной последовательностью: ранних Ре, средних Pm и поздних Р1. Терминация осуществляется на Rho-независимых терминаторах (Mosig et al, 1998).
Ранняя транскрипция осуществляется сразу после введения ДНК фага в клетку с 39 ранних промоторов, которые распознаются хозяйском РНКП. Ранние промоторы являются одними из самых сильных а70-промоторов, однако они короче, т.к. содержат неканоническую -35 последовательность (GTTTAC). Сила промоторов обуславливается тем, что -10 участок ранних промоторов является удлиненным в обе стороны от -10 положения и полиА-богатым участком в районе -42 —52 позиций, который является одними из самых сильных энхансеров транскрипции (Wood et al, 1994). Вместе с ДНК фага Т4 в клетку попадает несколько десятков копий молекул 70 кДа белка Alt, которые были упакованы в головку фага. Alt - это моно-АДФ-рибозилтрансфераза, которая катализирует АДФ-рибозилирование одной из а-субъединиц РНКП по остатку Arg265 в С-концевом домене а-субъединицы (a-CTD) (Kolesky, 1999). Существуют активаторы клеточной транскрипции, которые взаимодействуют с a-CTD, увеличивая сродство РНКП к промоторам, чаще всего благодаря специфическому узнаванию a-CTD АТ-богатых последовательностей в положениях -40 —100, что стимулирует транскрипцию в десятки раз. Поскольку промоторы фага Т4 не содержат АТ-богатых последовательностей в положениях -40 — -100, АДФ-рибозилирование a-CTD может понижать транскрипцию с клеточных