Исследование конкуренции между сплайсингом и полиаденилированием у Drosophila melanogaster

• Автор: Тихонов, Максим Васильевич
• Шифр специальности: 03.01.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 93 с. : ил.

Оглавление
Оглавление
Список используемых сокращений
1. Введение
1.1 Актуальность работы
1.2 Цели и задачи исследования
1.3 Научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы
1.4 Положения, выносимые на защиту
1.5 Степень достоверности и апробация результатов
2. Обзор литературы
2.1 Роль С-концевого домена большой субъединицы РНК-полимеразы II в организации транскрипционного комплекса
2.2 Распределение фосфорилирования С-концевого домена большой субъединицы РНК-полимеразы II как маркер стадии транскрипции
2.3 Процесс копирования и его влияние на другие ко-транскрипционные события
2.4 Ко-транскрипционный сплайсинг
2.5 Процессинг З'-конца мРНК
2.6 Упаковка транскрипта и связь с другими ко-транскрипционными процессами
2.7 Расщепление/полиаденилирование детерминирует терминацию транскрипции
2.8 Формирование петель у генов
3. Материалы и методы
3.1 Объекты
3.2 Молекулярное клонирование
3.2.1 Работа с бактериями

3.2.2 Общие методы работы с ДНК
3.2.3 Создание векторов с репортерной системой
3.3 Работа с культурой клеток S2 дрозофилы
3.3.1 Ведение культуры клеток S2 Drosophila melanogaster
3.3.2 Трансфекция клеток культуры S2 Drosophila melanogaster
3.4 Измерение активности люцифераз
3.5 Работа с РНК
3.5.1 Выделение РНК
3.5.2 Разделение ядерной и цитоплазматической фракций РНК
3.5.3 Нозерн-блот анализ
3.5.4 Количественная ОТ-ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени
3.6 Генетические методы
3.6.1 Трансформация эмбрионов Drosophila melanogaster и получение трансгенных линий
3.6.2 Фенотипический анализ экспрессии генов yellow и miniwhite в трансгенных линиях
3.6.3 Генетические скрещивания
3.7 Методы компьютерной обработки данных
3.7.1 Предсказание СПА
3.7.2 Поиск генов, полностью расположенных в интроне другого гена
3.7.3 Анализ паттерна экспрессии изоформ на основе данных секвенирования РНК
4. Результаты
4.1 СПА широко представлены в интронах Drosophila melanogaster
4.2 Экспериментальное подтверждение функционирования СПА в экзонах, но не
в интронах генов

4.3 СПА, встроенные в интрон, функционально выключены
4.3.1 Создание модельной системы для определения эффективности работы СПА
4.3.2 Проверка активности СПА в модельной системе
4.3.3 Установление особенностей работы терминатора в интроне гена yellow
4.3.4 Исследование активности инсулятора 1А2 и сигнала полиаденилирования в интроне гена yellow в трансгенных линиях Drosophila melanogaster
4.3.5 Проверка активности СПА внутри искусственного интрона
4.4 Использование СПА внутри интронов - редкое явление в геноме и, по всей видимости, является индуцибельным
5. Обсуждение
6. Выводы
Список цитированной литературы
Благодарности
Приложение

объемом 250 мл. Выращивали в течение 12 часов (до заметного помутнения раствора) при интенсивном перемешивании при 37°С. Клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин на 4750 оборотах/мин. Осадок ресуспендировали в 4 мл S 1-буфера (Tris 0,05 М, EDTA 0,01 М), выдерживали в течение 2 мин при комнатной температуре. Добавляли 4 мл буфера S2 (NaOH 0,2 М, SDS 1%), инкубировали в течение 2 мин при -20°С. Добавляли 4 мл АсК 3 М pH 5,2, плавно перемешивали, инкубировали в течение 5 мин при -20°С. Центрифугировали на 4750 оборотах/мин в течение 20 мин. Супернатант переносили в свежий фалькон, добавляли 10 мл изопропанола, плавно перемешивали, инкубировали в течение 10 мин при -20°С. Центрифугировали на 4750 оборотах/мин в течение 15 мин, осадок просушивали, растворяли в 1 мл 2 М AcNH4. Инкубировали в течение 10 мин при -20°С, переносили в 1,5 мл эппендорф, центрифугировали в течение 5 мин на 13200 оборотах/мин, отбирали супернатант в свежий эппендорф. Добавляли 700 мкл изопропанола, инкубировали в течение 10 мин при -20°С. Центрифугировали на 13200 оборотах/мин в течение 10 мин. Осадок промывали 100 мкл 70% этанола, подсушивали при 60°С, растворяли в нужном объеме деионизованной воды.
3.2.2.2 Выделение плазмидной ДНК из маленького объема бактериальной культуры (Miniprep)
Одну колонию переносили в 5 мл среды LB с ампициллином (Tryptone 1%, yeast extract 0,5%, NaCl 1%, Ампициллин 50 мг/л). Выращивали в течение 12 часов (до заметного помутнения раствора) при интенсивном перемешивании на 37°С. Переносили среду с бактериями в 1,5 мл эппендорф. Клетки осаждали центрифугированием в течение 1 мин на 13200 оборотах/мин. Осадок ресуспендировали в 200 мкл S1-буфера (Tris 0,05 М, EDTA 0,01 М), добавляли 200 мкл буфера S2 (NaOH 0,2 М, SDS 1%), инкубировали в течение 2 мин при -20°С. Добавляли 400 мкл AcNH4 7,5 М, плавно перемешивали, инкубировали в течение 10 мин при -20°С. Центрифугировали в течение 10 мин при 13200 оборотах/мин, супернатант переносили к 400 мкл изопропанола и инкубировали в течение 10 мин при -20°С. Центрифугировали в течение 15 мин на