Функция повторов аминокислотной последовательности белка Sfr1 в рекомбинационной репарации Schizosaccharomyces pombe

• Автор: Хасанова, Ольга Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 121 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2Л. Преимущества делящихся дрожжей для изучения репараци

двухцепочечныхповреждений ДНК

2.2. Гены рекомбинационной репарации 51. РотЬе

2.2.1. Белки 5. ротЬе, ответственные за образование 3’ - выступающих однонитевых участков в сайтах повреждений ДНК
2.2.2. Белки Б. ротЬе, ответственные за образование Лай51 -нуклеопротеинового филамента

2.3. Механизм рекомбинационной репарации в эукариотах

2.4. БМ и толерантность к УФ-повреждениям ДНК

2.5. Связь механизмов контроля клеточного цикла в репарации повреждений ДНК

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Штаммы, использованные в работе
3.2. Ростовые среды
3.3. Генетические скрещивания
3.4. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е.соП
3.5. Электрофорез ДНК в агарозном геле
3.6. Выделение ДНК из агароного геля с помощью набора Иискоярт (МасЬегеу-г^е1)
3.7. Получение компетентных клеток Е.соП ЭН5а
3.8. Трансформация клеток штамма Е.соП ПН5а
3.9. Трансформация клеток 51. ротЬе
3.10. Тесты клеток дрожжей на генотоксический стресс
, 3.11. Полимеразная цепная реакция
3.12. Выделение белка БД! из клеток Б.ротЪе
3.13. Электрофорез белков в полиакриламидном геле
3.14. Эксперимент с повышенной экспрессией белка БйТ
3.15. Тест на эффективность мейотической внутригенной рекомбинации в клетках 5. ротЬе
3.16. Тест на эффективность мейотической межгенной рекомбинации в клетках 5. ротЬе
3.17. Тесты на белок - белковые взаимодействия
3.18. Манипуляции с ДНК

3.19. Очистка His6 - меченого белка в денатурирующих условиях на Ni-NT__^
агарозе
" <5б
3.20. Приготовление хроматиновых спредов
3.21. Иммунофлуоресцентная микроскопия
ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИСЛЕДОВАНИЯ
4.1. Белок S. pombe Sfrl взаимодействует с рекомбиназой Rad51
4.2. Идентификация нового мотива в белке Sfrl и его анализ
4.3. Повышенная экспрессия PSA повторов приводит к Rad51 -зависимому доминант - негативному эффекту на выживаемость клеток

4.4. Мутации в PSA мотивах белка Sfrl приводят к ослабленной penaparItlj^
ДНК в клетках S. pombe

4.5. Мейотическая рекомбинация уменьшена в sfrl PSA — мутантных аллелях

4.6. Sfrl-мутантные аллели дефектны для взаимодействия с Rad51.._ ^
4.7. Образование фокусов Rad51, индуцированных ионизирующей радиацией, уменьшено в мутанте sfrl А

ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ
Двухцепочечные разрывы ДНК представляют собой серьезную опасность для клеточной жизнеспособности и стабильности генома. Двухцепочечные разрывы ДНК возникают в случае геномных перестроек, индуцированных нуклеазами (переключение типа спаривания в клетках дрожжей [1]); повреждений решшкационных вилок, вызванных продуктами метаболизма клеточного дыхания [2]; У(ОД рекомбинации [3] и в мейозе [4]. Двухцепочечные разрывы ДНК также возникают и при действии ДНК повреждающих факторов: ионизирующей радиации, химических веществ и УФ-света через образование алкилирующих аддуктов, пиримидиновых димеров и сшивок ДНК [5]. Не репарированные или неправильно репарированные двухцепочечные разрывы ДНК могут приводить к потере гетерозиготности, мутациям, геномным перестройкам и потере хромосомы. Для репарации двухцепочечных разрывов ДНК, главным образом, используются два механизма: негомологичное соединение концов ДНК (КНЕЗ) и гомологичная рекомбинация. N НЕI является предпочтительным способом в фазе в 1 клеточного цикла, тогда как гомологичная рекомбинация - в фазах Б и 02 [6, 7]. Более того, М-ЗЕЗ привносит больший вклад в репарацию двухцепочечных разрывов ДНК в клетках высших эукариот, геном которых включает протяженные межгенные области и повторяющиеся последовательности, тогда как гомологичная рекомбинация предпочтительна для дрожжей и других эукариот с небольшими геномами и короткими межгенными районами [8]. Механизм ЫНЕ.! представляет собой лигирование двух концов ДНК в сайте разрыва. Так как лигирование часто сопровождается нуклеолитическим процессингом концов ДНК, ИНЕЗ вызывает делеции. Рекомбинационная репарация представляет собой безошибочный способ исправления ошибок ДНК, поскольку использует информацию другого гомолога или сестринской хроматиды для репарации повреждения ДНК. Рекомбинационная репарация зависит от функции

nbsl XRS
Фенотип мутанта:
ИР4, ММС4, УФ", ГМ4,
дефект пролиферации,
синтетическая летальность rad62-l с rad2A
Белок: свойства и функция:
домены CCD и FHA, регуляция длины теломера; взаимодействует с Rad32; процессинг мейотических двухцепочечных разрывов; роль в негомологичном соединении концов ДНК, функция в чекпойнте повреждений ДНК в S-фазе, но не в Go
rad50 RAD
Фенотип мутанта:
ИР4, ММС4, УФ4, ГМ4 РЕК'
дефект пролиферации
синтетическая летальность rad50A с rad2A
Белок: свойства и функция:
функция в репликации ДНК и переключении типа спаривания, регуляция длины теломера; сайт связывания NTP; образует комплекс с Rad32 и Nbsl; процессинг мейотических двухцепочечных разрывов; роль в негомологичном соединении концов ДНК, функция в чекпойнте повреждений ДНК в S-фазе, но не в G
тж81 MUS
Фенотип мутанта:
ММС4, УФ4, РЕК'
чекпойнт - зависимая задержка митоза,
дефект пролиферации
Белок: свойства и функция:
субъединица эндонуклеазы (резолвазы); взаимодействует с Cdsl и Emel; разрезание структур Холлидея