Особенности функциональных взаимодействий SCS- и SCS'-инсуляторов, а также промоторов соседних коэкспрессирующихся генов дрозофилы

• Автор: Леман, Дмитрий Всеволодович
• Шифр специальности: 03.01.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 74 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА I. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА

1Л Основные принципы организации хроматина в ядре клетки

1.2 Доменная организация хроматина

1.3 Топологические ассоциированные домены (ТАД)

1.4 Механизмы образования хроматиновых доменов

ГЛАВА II. ЦИС-РЕГУЛЯТОРНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ. ОБЩИЕ СВОЙСТВА ИНСУЛЯТОРОВ И ПРОМОТОРОВ

2.1 Цис-действующие регуляторные элементы
2.2 Барьерные инсуляторы и промоторы
2.3 Энхансер-блокирующие инсуляторы и промоторы
2.4 Белки инсуляторов Drosophila melanogaster
2.5 Энхансер-блокирующие инсуляторы и хроматиновые петли
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Генетические методы
2.1.1 Линии Drosophila melanogaster, использованные в работе
2.1.2 Трансформация эмбрионов Drosophila melanogaster и получение трансгенных
линий
2.1.4 Генетические скрещивания
2.2 Биохимические методы
2.2.1 Работа с бактериальным штаммом E.coli DH5a
2.2.2 Работа с ДНК
2.3 Создание трансгенных конструкций
3 РЕЗУЛЬТАТЫ
Часть I: Исследование SCS- и SCS'-инсуляторов
3.1 Исследование функционального взаимодействия между SCS- и SCS’-инсуляторами
3.2 Тестирование SCS- и SCS'-инсуляторов на промоторную активность в эмбриональных 82-клетках
3.3 Обнаружение функционаьного сигнала полиаденилирования в последовательности SCS-инсулятора
3.4 Тестирование SCS-инсулятора на терминирующую активность в глазных имагинальных дисках Drosophila melanogaster
3.5 Тестирование SCS-инсулятора на промоторную активность в глазных
имагинальных дисках Drosophila melanogaster
Часть II: Дистальное взаимодействие промоторов CG3777 и yellow
3.6 Промоторы генов CG3777 uyellow функционально взаимодействуют друг с другом
3.7 Результат взаимодействия между промоторами генов CG3777 и yellow
зависит от их взаимного расположения
4 ЗАКЛЮЧЕНИЕ
4.1 Новые свойства SCS- и SCS’-инсуляторов
4.2 Функциональные взаимодействия промоторов yellow и CG3
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
DRE - DNA replication-related element- последовательность 5'-TATCGATA-3' в составе некоторых промоторов генов
BRE - TFIIB recognition element - элемент, узнаваемый транскрипционным фактором TFIIB
МТЕ - motif ten element — мотив длиной 10 п.н.
Inr - initiator element - инициаторный элемент.
DPE - downstream promoter element - элемент, находящийся после старта транскрипции.
ТАТА-бокс - коровая последовательность большинства промоторов
ANT-C - antennapedia комплекс
fiz - ген fushi tarazu
Scr — ген Sex combs reduced
mod(mdg4) — ген modifier of mdg
Abd-B - ген Abdominal-B
hsp70 - ген heat shock protein
Hox - гомеозисный ген
Ey - энхансеры тела и крыльев гена yellow
Ее - энхансер глаз гена white
TFIIC - transcription factor IIC - транскрипционный фактор TFIIC TFIIB - transcription factor ИВ - транскрипционный фактор TFIIB TADs — topologically associating domains PRE - polycomb responsible element Pc - белки семейства Polycomb
CTCF - белковый фактор связывающийся с последовательностью СССТС Mod(mdg4) - белок, кодируемый геном mod(mdg4)
GAF (GAGA assotiated factor) - транскрипционный фактор GAGA СР190 - белок centrosomal protein
Su(Hw) - белок suppressor of Hairy-wing, кодируется геном su(hw)
BEAF - белок boundary-element-associated factor

Полученную «творожную» смесь плавно перемешали и оставили инкубироваться 15' на -20°С. После центрифугирования на 4750 rpm 20', супернатант перенесли в свежий фалькон, добавили 10 мл изопропанола, тщательно перемешали и инкубировали 10'. Отцентрифугировав 20' на 4750 rpm и выкинув супернатант, осадок просушили и растворили в 1 мл AcNI-Lt (2М, pH 7,4). Проинкубировав в течение 10' на холоде, отцентрифугировали на 13200 rpm 5'-6’. Супернатант перенесли в свежий эппендорф, добавили 700 мкл изопропанола и вновь инкубировали 10'. После очередного центрифугирования на 13200 rpm 10', супернатант отбросили, а осадок промыли 100-200 мкл С2Н5ОН 70%. Предварительно подсушив, осадок растворяли в нужном объеме Н2О mQ.
Выделение плазмидной ДНК из меньшого объема (Miniprep)
Одну колонию перенесли в 5 мл среды LB с ампицилином в стеклянные пробирки. Клетки наращивали 12-18 часов (до заметного помутнения раствора) на качалке при 37°С. Далее среду с бактериями перенесли в эппендорф и отцентрифугировали на 13200 rpm в течение 5'. Слив супернатант, осадок сначала растворили в 200 мкл буфера SI (Vortex, инкубация 2’ при комнатной температуре), затем добавили 200 мкл буфера S2 (инкубация 2'-4' на льду) и 400 мкл АсЫШ 7,5М (Ю'-15' на -20°С). Отцентрифугировав смесь 10’ на 13200 rpm, супернатант перенесли в 400 мкл изопропанола, предварительно охлажденного на -20°С. Пробирки проинкубировали 10', центрифугировали на 13200 rpm 15'. Осадок промыли в 100 мкл С2Н5ОН 70%, высушили и растворили в необходимом объеме Н2О mQ.
Выделение геномной ДНК из Drosophila melanogaster
Мух (0,1-0,12г) растирали пестиком в рабочем буфере A (Tris-HCl ОДМ, pH 9,0; ЭДТА 0,1М, pH 8,0; SDS 1% и DEPC 1%). Смесь выдерживали 30' при 70°С, затем добавляли раствор АсК 8М (объем должен был составить 1/7 от объема буфера А), перемешивали и ставили на 30' в ледяную баню. После чего смесь центрифугировали, отбирали водную фазу, затем ДНК экстрагировали смесью фенол-хлороформа (1:1) и хлороформом. Экстрагированную ДНК осаждали добавлением 0,6 объема изопропанолового спирта, промывали 70% этанолом и растворяли в необходимом количестве mQ. В некоторых случаях для получения особо чистой ДНК пробы обрабатывали РНКазой А с последующей очисткой фенолом, фенол-хлороформом и хлороформом.