Регуляция транскрипции и пространственная организация гена AML1/RUNX1 человека

• Автор: Маркова, Елена Николаевна
• Шифр специальности: 03.01.07, 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 111 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений.

Введение

1. Обзор литературы.

1.1. Общая характеристика семейства транскрипционных факторов РиЫХ.

2.2. Транскрипционный фактор РиЫХ1.

2.2.1. Структура транскрипционного фактора

2.2.2. Мишени регуляции.

2.2.3. Экспрессия гена X1 в различных тканях.

2.3. Участие гена ЯСЛШ в транслокациях

Постановка задачи и методические подходы.

2. Материалы и методы
2.1. Материалы.
2.1.1. Клеточные линии
2.1.2. Бактериальные штаммы.
2.1.3. Химические реактивы
2.1.4. Программное обеспечение
2.2. Методы
2.2.1. Культивирование клеточных линий
2.2.2. Выделение геномной ДНК из культивируемых клеток
2.2.3 Выделение тотальной РНК из культивируемых клеток.
2.2.4. Спектрофотометрическое определение концентрациинуклеиновых кислот . .
2.2.5. Обратная транскрипция и ПЦРв реальном времени.с пробами на матрице.кДНК
2.2.6. Приготовление генноинженерных конструкций
227. Транзиентная трансфекция.
2.2.8 Измерение активности люциферазьг в экстрактах трансфецированныхклеток
2.2.9. Задержка электрофоретической подвижности в геле.
2.2. ЗСанализ. .
2.2. Анализ способности фрагментов ДНК связываться с ядернымбелковым матриксом i vi
3i. Результаты исследований
3 Промоторы П1 и П2 гена X1 человека дифференциально
активны в разных типах клеток .
3.2 Выбор потенциальных регуляторных элементов.в составе гена
X1 человека
.3.3 Выбранные элементы РЭТ и РЭ2 образуют комплексы предпочтительно с белками ядерного экстракта лимфоидных
клеток
3.4. Элемент РЭ1 является тканеспецифичным энхансером по отношению к промоторам П1 и П2 гена X1 человека, РЭ2 не
обладает активностью энхансера по отношению к тем же
промоторам
3.5. Промоторы П1 и П2, а также элементы РЭ1 и РЭ2 гена X1 человека собраны в активаторный блок транскрипции в лимфоидных и эритроидных клетках
3.6. Элемент РЭ2 не связывается с ядерным белковым матриксом i vi
4. Обсуждение результатов.
Выводы.
Список литературы


пробами на матрице. Транзиентная трансфекция. Задержка электрофоретической подвижности в геле. ЗСанализ. Выбор потенциальных регуляторных элементов. Обсуждение результатов. Выводы. Список литературы. Впервые ген X1 человека был идентифицирован в году как один из участников хромосомной перестройки 8, ассоциированной с острой мислоидной лейкемией ii, ii . Позднее, через два года было установлено, что X1 кодирует белок, который относится к семейству эволюционно консервативных транскрипционных факторов, содержащих в своем составе ДИКсвязывающий домен , iIi . , . В дальнейшем, в процессе изучения гена X было установлено, что он является участником самых разнообразных хромосомных перестроек, например 3, 5, и . Таким образом, ген X стал известен как самая частая мишень хромосомных повреждений, вызывающих острые формы лейкемии i . Впервые физиологическая функция фактора X1 была установлена в году в экспериментах на трансгенных мышах. Было показано, что при повреждении обеих аллелей этого гена эмбрионы мышей погибали на ранних этапах внутриутробного развития изза нарушения процесса дефинитивного гематопоэза в эмбриональной печени , v . i, i . , . , . После этого было проведено много исследований, посвященных изучению структуры фактора X1 и его участия в регуляторных каскадах, поискам геновмишеней регуляции ii, i . i, . . , . , . Тем не менее, на сегодняшний день до сих пор остается неизученным механизм регуляции экспрессии гена X1 человека в нормальных условиях, в отсутствие мутаций и нарушений его структуры. Известно, что его транскрипция осуществляется строго в определенное время и только в определенных типах клеток. Также были локализованы промоторные участки этого гена, но оказалось, что они не имеют тканевой специфичности в составе модельных конструкций с репортерным геном i, i . Это в свою очередь означает, что внутри самого гена X1 должны существовать специальные регуляторные элементы, за счет которых осуществляется тонкая пространственновременная настройка его экспрессии в организмах позвоночных. Но до сих пор подобные элементы не были локализованы. В настоящей работе мы попытались найти потенциальные тканеспецифичные эихансеры гена X1 человека, используя методы биохимии, компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей и последние литературные данные, проанализировали их влияние на промоторы этого гена и изучили пространственную организацию всего локуса в разных типах культивируемых клеток человека. К семейству белков X относятся три транскрипционных фактора X1, 2 и 3 также приняты названия 1, 3 и 2 соответственно. Эти эволюционно консервативные транскрипционные факторы принимают участие в регуляции важнейших процессов в организме млекопитающих гематопоэза X1, остеогенеза X2, нейрогенсза, тимопоэза и регуляции пролиферации клеток эпителия желудка X3. Каждый из белков кодируегея только одним геном, но в результате альтернативного сплайсинга образуются различные изоформы белков X. В концевой части всех этих белков находится консервативный домен, размером 8 аминокислотных остатков, гомологичный транскрипционному фактору . , . домен взаимодействует с определенной последовательностью ДНК этот сайт носит название i ii . домен не только связывает ДНК, но и взаимодействует с факгором ДНК, но упрочняет взаимодействие этого домена с ДНК. Фактор и i i. Таким образом, X белки в комплексе с фактором i . Гены, кодирующие факторы, содержащие домен, были идентифицированы в геномах многих организмов. Самый примитивный ортолог был найден у нематоды.