Свойства и функции Su(Hw)-зависимых инсуляторов у Drosophila melanogaster

• Автор: Головнин, Антон Клеменсович
• Шифр специальности: 03.01.07
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 285 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
I. ОРГАНИЗАЦИЯ ЭУКАРИОТИЧЕСКОГО ГЕНОМА
1.1 Геном эукариот организован в домены
1.2. «Молчащие» домены
1.3. Активные домены
1.4 Участки хроматина взаимодействующие с ядерным матриксом
1.5 Новый взгляд на устройство хроматина
1.6 Структурная организация хроматина в ядре
1.7 Регуляция экспрессии кластеризованных генов
II. ИИСУЛЯТОРЫ
2.1 Свойства инеуляторов
2.2 Инсуляторы позвоночных
2.2.1 Инсулятор р-глобинового кластера
2.2.2 Инсулятор igf2/hl9 локуса
2.3 Барьерные элементы дрожжей
2.4 Инсулягоры дрозофилы
2.4.1 scs и scs ' инсуляторы
2.4.2 CTCF-зависнмые инсуляторы
2.4.3. Инсулятор Su(Ilw)
2.4.4. Эндогенные инсуляторы Sit(Hw) и инсуляторные тельца
2.4.5. Нейтрализация инеуляторов
2.5 Механизм действия инеуляторов
Ш. SUMO: НОВЫЙ УЧАСТНИК ПОСТТРАНСЛЯЦИОННОЙ. МОДИФИКАЦИИ БЕЛКОВ
3.1 Функции белков семейства SUMO
3.2. Путь конъюгации белка SUMO
3.2.1. Особенности строения белка SUMO
3.2.2. Функции и особенности SUMO-активирующего фермента El
3.2.3. Функции и особенности SUMO-конъюгирующего фермента Е
3.2.4. Функции и особенности SUMO-пигаз ЕЗ
3.2.5. Ферменты десомулирования
3.2.6. Специфичность субстратов сумолирования
3.2.7. Регуляция активности белков через SIM (SUMO interaction motif)
3.3. Биологическая роль SUMO-модификации
3.3.1. SUMO-модификация участвует в регуляции различных процессов жизнедеятельности клетки
Сумолированис регуляторов транскрипции
Сумолирование белков, ассоциированных с репарацией ДНК
Сумолирование белков, участвующих в транспорте через ядерные поры
Участие сумолирования в организации и функционирование хромосом
3.3.2 Инсуляторные белки сумолируются in vitro и in vivo
3.3.3. Формирование ядерпых телец PA1L

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Реактивы
2. Программное обеспечение, базы данных
3. Олигонулеотидные праймеры
4. Штаммы бактерий, дрожжей и линия культуты клеток
Drosophila melanogaster использованные в работе
5. Среды для выращивания бактерий, дрожжей и культуры клеток Drosophila melanogaster
6. Антитела
7. Линии и мутации Drosophila melanogaster использованные в работе
8. Генетические методы
8.1 Трансформация эмбрионов Drosophila melanogaster и получение трансгенных линий
8.2 Фенотипический анализ экспрессии генов yellow и miniwhite
в трансгенных линиях
8.3 Генетические скрещивания
9. Биохимические методы
Работа с ДНК
9.1 Выделение ДНК из дрозофилы
9.2 Саузерн-блот анализ
9.3 Приготовление компетентных клеток для трансформации
илазмидиой ДНК
9.4 Трансформация компетентных клеток плазмидами
9.5 Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса
9.6 Полимеразная цепная реакция
9.7 ПЦР в реальном времени (Real-time PCR )
9.8 Обратная транскрипция
9.9 Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции
9.10 Лигирование ДНК
9.11 Тупление выступающих концов ДНК
9.12 Агарозный гель-электрофорез
9.13 Выделение фрагментов ДНК из геля и очистка ДНК от продуктов ферментативных реакций
9.14 Определение нуклеотидной последовательности
9.15 Создание рекомбинантных генетических конструкций для получения трансгенных линий Drosophila
9.16 Получение мутаций в гене mod(mdg4)
9.17 Получение векторов для дрожжевой двугибридной системы
9.18 Получение конструкций, зксирессирющих белки CP19Ü, Mod(mdg4)-67.2 и его мутантные
производные в 32-клетках Drosophila
Работа с белками
9.19 Синтез и выделение белков
9.20 Электрофорез белков в денагурирующем 8% ПААГ
9.21 Вестерн-блот анализ
9.22 Задержка в геле комплекса ДНК-бслок
9.23 Детекция белков на нолитенных хромосомах дрозофилы
9.24 Детекция белков в клетках имагинальных дисков дрозофилы
Работа с дрожжами
9.25 Культивирование дрожжей

9.26 Трансформация дрожжевых клеток
9.27 Анализ взаимодействий в дрожжевой двугибридной системе
Работа с культурой клеток Б
9.28 Трансфекция 82 клеток
9.29 Получение клеточного лизата из 82 клеток
9.30 Получение ядерного лизата из 82 клеток
9.31 Иммунопреципитация
9.32 11ммунопреципитация хроматина
9.33 Окрашивание клеточных препаратов
9.34 РНК-интерфереция
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Г.Взаимодействие между двумя Su(Hw) инсуляторами
1.1 Создание модельной системы для изучения свойств инсулятора Su(Hw)
1.2 Два инсулятора Su(Hw), окружающие либо энхансеры, либо промотор гена yellow, сохраняют способность блокировать взаимодействия между эихансером и промотором
1.3 Два инсулятора Su(Hw) , расположенные между энхансерамн и промотором reimyellow, не способны блокировать взаимодействие между энхансером и промотором
1.4 Два инсулятора Su(Hw), расположенные между энхансером и промотором гена miniwhile, способствуют энхансер-промоторным взаимодействиям
1.5 Исследование влияния мутации mod(mdg4)l"‘ на экспрессию гена miniwhite в линиях EyEwSYSW..
1.6 Роль положения инсуляторов Su(Hw) в составе конструкций и расстояния между ними в нейтрализации инсуляции
1.7 Взаимодействие между двумя Su(Hw) инсуляторами зависит от их взаимной ориентации
И. Взаимодействие инсулятора Su(Hw) с промотором на больших дистанциях
2.1 Инсулятор Su(Hw) способен стимулировать транскрипцию гена yellow, ослабленного делецией предпромоторного района
2.2 Сила стимуляции транскрипции напрямую зависит от количества сайтов связывания для белка Su(Hw)
2.3 Инсулятор Su(Hw) не компенсирует делецию энхансера гена yellow
2.4 Функциональный анализ доменов белка Su(Hw), участвующих в стимуляции транскрипции гена yellow
III. Первый эндогенный Su(Hw)-3aBHCHMbiii инсулятор обнаруженный у Drosophila. .”
3.1 Последовательность между генами yellow и achaete, дуплицированная в регуляторную область AS-C, нарушает экспрессию гена scute
3.2 Последовательность между генами yellow и scute содержит функциональные сайты связывания белка Su(Hw)
3.3 Мутации в генах su(Hw) и mod(mdg4) влияют на экспрессию генов
в составе AS-C
IV. Структурная и функциональная характеристика белка Мо<1(т£^4)-67.2 как компонента 8и(1Гм)-завпсимого ннсуляторного комплекса
4.1 Наличие определенных точечных замен в “заряженном кармане” не влняег на способность белка Мо<1(пи^4)-67.2 взаимодействовать с белком 8и(Н) и димеризоваться
4.2 Белок Моб(тс^4)-67.2 содержит второй домен, отвечающий за димеризацню
4.3 Функциональная активность мутантных форм белка Моб(тс^4)-67.2 в работе инсулятора 8и(Ж’)..
4.4 Локализация различных форм белка па политенных хромосомах и в «инсуляторных тельцах» в ядрах диплоидных клег ок
4.5 Ипсуляторные свойства мутантных форм белка Мос1(шс1§4)-67.2 не зависят напрямую от их способности взаимодействовать с белком СР
V. Исследование взаимосвязи между образованием «инсуляторных телец» и инсуляцией
5.1 Мутантные варианты белка Мос1(пц^4)-67.2 использованные в работе
5.2 Локализация Моб(тс^4) производных в 82-клетках

- ß-gioDtn domain -
5'HS4 HS3 HS2HS1 Condensed chromatin

1111 f,
ßA/e Enhancer, 3' pH ßA| £ I
і—ft Гг- -f/i—А-В-Є-5-&-

Enhancer blocking
Enhancer blocking
CTCF 1 Fill CluSFl«r>dUSF2n FV ] 3 CTCF a
Рисунок 7. Структура ß-глобинового кластера курицы (Gaszner and Felsenfeld, 2006).
трансгенную конструкцию (Chung et al., 1993). Коровая последовательность этого инсулятора содержит несколько сайтов связывания для белка CTCF. Белок CTCF содержит 11 доменов типа «цинковые пальцы» и встречается во всех организмах от Drosophila до человека (Moon et al, 2005). Белок CTCF может принимать участие в активации транскрипции (Vostrov and Quitschke, 1997), в подавлении экспрессии гена (Baniahmad et al, 1990; Lobanenkov et al, 1990) и в блокировании энхансера (Bell et al, 1999; Flark et al, 2000; Kanduri et al, 2000; Szabo et al, 2000; Filippova et al, 2001; Lutz et al, 2003; Tanimoto et al, 2003). Инактивация Х-хромосомы у позвоночных и контроль за эпигенетическим метилированием ДНК также зависят от белка CTCF (Lee, 2003).
Энхансер-блокирующая и барьерная активности 5’HS4 инсулятора зависят от
разных белков и разных последовательностей ДНК. Так, на энхансер-блокирующую
активность влияет связывание белка CTCF, а барьерные функции зависит от
ацетилирования окружающих гистонов (Burgess-Beusse et al., 2002). Ацетилирование
гистонов не зависит от присутствия белка CTCF, для этого необходимы белки USF1 и
USF2, сайты связывания для которых не пересекаются с сайтами связывания для белка