Идентификация новых генов дрожжей S. pombe и их роль в рекомбинационной репарации ДНК

• Автор: Хасанов, Фуат Каримович
• Шифр специальности: 03.01.07
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 263 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 2.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Рекомбинационная репарация в А ротЬе: роль в поддержании целостности генома
2.2. Преимущества делящихся дрожжей для изучения репарации двухцепочечных разрывов ДНК
2.3. Гены рекомбинационной репарации 5. ротЬе
2.3.1. Белки А ротЬе, ответственные за образование 3’- выступающих однонитевых участков в сайтах повреждений ДНК
2.3.2. Белки, ответственные за образование Яаб51 -нуклеопротеинового филамента
2.4. Механизм рекомбинационной репарации в эукариотах
2.5. БйТ и толерантность к УФ - повреждениям ДНК
2.6. Связь механизмов контроля клеточного цикла и репарации повреждений

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Штаммы, среды и ростовые условия
3.2. Использованные библиотеки ДНК и плазмиды
3.3. Конструирование делеции гена У. ротЬе гкр55+
3.4. Конструирование делеционного штамма Б.ротЪе г1р!
3.5. Обнаружение и клонирование У ротЬе 4/К/+
3.6. Конструирование делеционного мутанта У. ротЬе а/г1А::агрЗ+
3.7. Эксперимент с повышенной экспрессией белка БМ
3.8. Выделение белка БйТ из клеток У. ротЬе
3.9. Манипуляции с ДНК
3.10. Тесты на клеточный ответ на генотоксический стресс
3.11. Мейотический тайм-курс и Нозерн анализ

3.12. Определение уровня образования двуцепочечных разрывов ДНК в локусе У. pombe matl
3.13. Тесты на белок - белковые взаимодействия
3.14. Конструирование слитого белка His6-Rhp
3.15. Конструирование аллелей rhp55K57A и -K57R, а также rhp57K106A и K106R в хромосоме S. pombe
3.16. Конструирование аллелей sfrl-K108E и sfrl-K164E, а также sfrl-F107E и sfrl-F163E в хромосоме S. pombe
3.17. Рекомбинационный эксперимент на митотических клетках
3.18. Эффективность споруляции и жизнеспособность спор
3.19. Тесты на определение уровней мейотической рекомбинации
3.20. Цитология и проточная цитометрия
3.21. Приготовление хроматиновых спредов
3.22. Иммунофлуоресцентная микроскопия
3.23. Тест на образование ДНК - белковых комплексов в агарозном

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИСЛЕДОВАНИЯ
4.1. rhp55 + кодирует новый белок S. pombe с гомологией к RecA
4.2. rhp55+ транскрибируется в вегетативно растущих клетках и индуцируется в мейозе
4.3. rhp55 + является геном репарации повреждений ДНК
4.4. кДНК rhp55+ комплементирует дефект в репарации повреждений ДНК, вызванный мутацией rhp55A
4.5. S. pombe Rhp55 функционирует в одном пути с белками Rad
и Rhp
4.6. Клетки rhp55A содержат аберантные нуклеусы и показывают повышенное содержание ДНК
4.7. Делеция гена У. pombe rhp55 приводит к нарушениям мейоза и вызывает небольшое снижение мейотической рекомбинации
4.8. Rhp55 и Rhp57 взаимодействуют in vivo
4.9. Мутации в Walker мотиве «А» белков Rhp55 и Rhp57 приводят к ослабленной репарации ДНК
4.10. Эффект мутаций в доменах связывания/гидролиза АТФ на функцию комплекса Rhp55-Rhp57 в клеточной пролиферации
4.11. Белки репарации двуцепочечных разрывов ДНК S. pombe вовлечены во взаимные взаимодействия
4.12. Взаимодействия, включающие белки S. pombe Rad22, Rtil и Rpal.l
4.13. Штаммы h90 с делениями генов гкр5Г и rhp55 показывают «крапчатый» фенотип и образуют гетероталличные сегреганты
4.14. Дефект клеток мутанта с делецией гена rhp55+ в переключении типа спаривания возрастает при понижении температуры
4.15. Анализ организации геномной области, ответственной за переключение типа спаривания в клетках сегрегантов
4.16. Секвенирование области smt у сегрегантов h90 с делецией гена rhp55+ показывает присутствие перестроек ДНК
4.17. Замещение последовательности ТТТССА на GTTTGTG в области SAS2 не коррелирует с низким уровнем образования разрывов ДНК в matl:l..
4.18. rlpl+ кодирует новый RecA-подобный белок S. pombe с высокой гомологией к белку человека XRCC
4.19. rlpl+ является геном репарации повреждений ДНК, действующим в одном пути с rhp51+, rhp54+ и rhp55+
4.20. Rlpl не имеет роли в репарации УФ-повреждений и в ответе на репликационный стресс
4.21. Спонтанная митотическая внутрихромосомная рекомбинация в мутанте rlpl
4.22. Мейоз и переключение типа спаривания в мутанте rlpl
4.23. Дрожжевой двугибридный анализ взаимодействий Rlpl с другими белками рекомбинационной репарации
4.24. Дрожжевой двугибридный анализ взаимодействия Rlpl с мейотическим гомологом S.pombe
репарационным фенотипом. Мутант гас!22 менее чувствителен к радиации, чем мутанты г!гр51, г!гр54 и гкр55 [62, 75], тогда как мутант 5. сегсушае гас152 так-же высоко-чувствителен к облучению, как и мутанты гас!51 и г ас!5 4 [78]. У 5. сегехпзгае, как мы упоминали, ранее, гомологи всех этих генов составляют одну /?/Ш52-эпистатичсскую группу и участвуют в едином механизме репарации. Относительно слабая чувствительность мутанта га<222::ига4+ к радиации позволяет предполагать, что белок ЫасШ в репарации индуцированных двуцепочечных разрывов в У. ротЬе играет более скромную роль, чем его гомолог Яаб52 в У. сегегаше. Важно также отметить, что мутация гас!22::ига4+ приводит к снижению уровня негомологичного соединения концов ДНК, другого пути репарации двуцепочечных разрывов [43], а это, в свою очередь, позволяет предполагать, что ген гас!22 играет роль в этом процессе. Ген & ротЪе Ш1 выделен в виде мультикопийного супрессора термочувствительной мутации га<422-Нб [79]. Повышенная экспрессия гена гШ приводит к существенному снижению чувствительности клеток мутанта гас122 к УФ-лучам, радиомиметику блеомицину, а также к стерильности и летальности при переключении типа спаривания [79]. Однако, в отличие от мутанта гас!22::ига4+, мутант гП'7А практически так же устойчив к воздействию ультрафиолета и блеомицина, как и клетки дикого типа. Кроме того, мутация Ш7Д несущественна в к90-клетках. Это позволяет предполагать, что либо гШ не участвует в репарации УФ-повреждений и двуцепочечных разрывов, либо в его отсутствие функцию этого гена берет на себя ген га<422. Умеренная чувствительность к ультрафиолету и радиации, а также летальность гомоталличных клеток мутанта гас!22 свидетельствуют о том, что Ш1 не может заменять гас122 в репарации как индуцированных двуцепочечных разрывов, так и разрывов, возникающих при переключении типа спаривания. Таким образом, в гегероталличных клетках, где практически отсутствуют двуцепочечные разрывы, генерируемые в процессе переключения типа спаривания, мутанты гН !А и тс122 жизнеспособны, и лишь последний проявляет митотический