Разработка метода стабилизации трансгенов после их интеграции в геном

• Автор: Ткачук, Артем Петрович
• Шифр специальности: 03.01.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 118 с. : ил.

Содержание
1. Введение
2. Обзор литературы
2.1 Перспективы использования трансгенных насекомых в программах биоконтроля
2.1.1 Современный биоконтроль
2.1.2 Метод стерилизации насекомых (SIT)
2.1.3 Оптимизация SIT и современные методы биоинженерии
2.1.4 Перспективы использования SIT для предупреждения трансмиссивных заболеваний человека
2.1.5 Метод замещения популяций
2.2 Методы получения трансгенных насекомых
2.2.1 Р-элемент
2.2.2 Hermes
2.2.3 Minos и mariner
2.2.4 piggyBac
2.2.5 Сайт-специфическая интеграция трансгенов
2.2.6 Маркеры трансгенеза
2.3 Риски ремобилизации трансгена и способы его стабилизации
2.3.1 Причины возможной ремобилизации трансгена в природной популяции
2.3.2 Способы стабилизации трансгенов
2.4 Получение делеций при помощи направленной индукции дву цепочечных разрывов ДНК

2.4.1 Механизмы возникновения делеций при репарации двуцепочечных разрывов
2.4.2 Мегануклеазы I-Sce I и I-Cre I
2.4.3 Применение мегануклеаз и репарации индуцированных двуцепочечных разрывов ДНК в исследованиях на Drosophila
2.5 Перспективы развития методов постиптеграционной стабилизации трансгенов
3. Материалы и методы
3.1 Генетические методы
3.1.1 ЛинииD. melanogaster, использовавшиеся в работе
3.1.2 Трансформация эмбрионов D. melanogaster и получение трансгенных линий
3.1.3 Определение хромосомы, на которой находится встроенная в геном конструкция
3.1.4 Введение трансгенов I-Sce I и 1-Сге Г в лабораторные линии.
3.1.5 Введение драйверов мегануклеаз I-Sce I и I-Cre I в трансгенные линии
3.1.6 Программное обеспечение. Базы данных
3.2 Биохимические методы
3.2.1 Выделение ДНК из D. melanogaster
3.2.2 Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Праймеры, использовавшиеся в работе
3.2.3 Молекулярное клонирование
3.2.4 Приготовление компетентных клеток линии E.coli DH5a
3.2.5 Трансформация бактериальных клеток плазмидами
3.2.6. Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса

3.2.7 Определение концентрации ДНК
3.2.8 Спиртовое переосаждение ДНК
3.3 Создание генетических конструкций
3.3.1 Конструкция Casper transgene stability (CTS)
3.3.2 Конструкция phiC31TS51D
3.3.4 Создание конструкции phiC31TS51D2xSce
4. Результаты
4.1 Разработка метода для сайт-неспецифической интеграции и стабилизации трансгенов в модельной системе D. melanogaster
4.1.1 Выбор эффективного механизма репарации двуцепочечных разрывов ДНК в качестве основного инструмента метода
4.1.2 NHEJ репарация двуцепочечных разрывов ДНК как основной способ делеции плеча транспозона
4.2 Разработка метода для сайт-специфической интеграции и стабилизации трансгенов в модельной системе D. melanogaster
4.2.1 Стабилизация трансгенов за счет последовательной делеции плечей транспозона с помощью SSA репарации индуцированных двуцепочечных разрывов ДНК
4.2.2 Одновременная делеция плечей транспозона как высокоэффективный способ стабилизации трансгенов
5. Обсуждение
7. Выводы
8. Список литературы
Приложение

мент доступны. На рисунке 9 приведена схема последовательности, включающая аИР сайт и маркерный ген - ИГР. Наличие 1охР сайтов для рекомби-назы Сге позволяет удалять последовательность маркерного гена. Г єн рЬІСЗ 1 интегразы также встроен в геном реципиента, поэтому для трангенеза необходимо инъецировать только генетическую конструкцию, содержащую интересующую нас последовательность.

62 В. 68Е_

86F>—

64Д 102-&S

—<86D

Рисунок 8. Схема инсерций attP сайтов в геном D. melanogaster
<]—)іохР}-|Зх-РЗ(- RFP tubal fj ІохР(-{attP (—f> m{3'} m(5'|
Рисунок 9. Схема интегрированных в геном D. melanogaster attP сайтов, по которым может происходить интеграция трансгена с помощью интегразы фага phiC31. Где т(З’) и т(5’) - плечи транспозона mariner, 1охР — сайты ре-комбиназы Сге, Зх-РЗ - тканеспецифический промотор, RFP — ген красного флуоресцентного белка, tubal - последовательность полиаденилирования гена tuba
Эффективность интеграции с помощью интегразы фага рЫСЗ 1 составляет в среднем около 50%, что в 5-10 раз выше, чем у грансгенеза с помощью транспозопов (Venken et al., 2006; Oberstem et al., 2005). Размер интегрируемой последовательности может достигать 146 т.п.н. (Venken et al., 2006). Существует вероятность того, что рекомбинация может пройти не только между attP и attB сайтами, но и между attB сайтом и последовательностью, гомо-