Идентификация возбудителей болезней Шмалленберг и Акабане на основе ПЦР в режиме реального времени

• Автор: Никитина, Елена Григорьевна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Вольгинский
• Количество страниц: 151 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Оглавление

Список сокращений

1 ВВЕДЕНИЕ

1.1 Актуальность темы

1.2 Степень разработанности проблемы

1.3 Цель работы и задачи исследования

1.4 Научная новизна результатов исследования

1.5 Теоретическая и практическая значимость

1.6 Степень достоверности и апробация работы
1.7 Публикации по теме диссертации
1.8 Структура и объем диссертационной работы
1.9 Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту
1.10 Личный вклад соискателя
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1 Краткая характеристика семейства Випуауігісіае
2.2 Краткая характеристика болезни Акабане
2.2.1 Структура вируса
2.2.2 Устойчивость вируса в объектах внешней среды
2.2.3 Эпизоотологические данные
2.2.4 Вирулентные свойства вируса болезни Акабане
2.2.4.1 Патогенез
2.2.4.2 Клинические признаки
2.2.4.3 Патологоанатомические изменения
2.2.5 Диагностика болезни Акабане
2.2.5.1 Вирусологические методы диагностики
2.2.5.2 Серологические методы диагностики

2.2.5.3 Генодиагностика
2.2.6 Меры борьбы и профилактика
2.3 Краткая характеристика болезни Шмалленберг
2.3.1 Структура вируса
2.3.2 Устойчивость вируса в объектах внешней среды
2.3.3 Эпизоотологические данные
2.3.4 Вирулентные свойства вируса болезни Шмалленберг
2.3.4.1 Патогенез
2.3.4.2 Клинические признаки
2.3.4.3 Патологоанатомические изменения
2.3.5 Диагностика болезни Шмалленберг
2.3.5.1 Вирусологические методы диагностики
2.3.5.2 Серологические методы диагностики
2.3.5.3 Генодиагностика
2.3.6 Меры борьбы и профилактика
2.4 Дифференциальная диагностика болезней Шмалленберг и Акабане
2.5 Филогенетический анализ вирусов
2.6 Заключение по обзору литературы
3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1 Материалы
3.1.1 Вирусы
3.1.2 Животные
3.1.3 Плазмиды
3.1.4 Культуры клеток
3.1.5 Химические реактивы
3.1.6 Лабораторное оборудование
3.2 Методы
3.2.1 Культивирование вируса болезни Акабане, получение и

титрование вируссодержащего материала
3.2.2 Заражение животных
3.2.3 Выделение нуклеиновых кислот
3.2.4 Выделение и очистка ПЦР - продукта
3.2.5 Постановка реакции обратной транскрипции
3.2.6 Постановка ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени
3.2.7 Анализ продуктов ПЦР
3.2.8 Клонирование ПЦР-продукта в плазмидный вектор
3.2.9 Компьютерный анализ и сравнение нуклеотидных повледовательностей, расчет олигонуклеотидов
4 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
4.1 Разработка тест-системы для выявления генома вируса болезни Шмалленберг методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени
4.1.1 Подбор специфических праймеров
4.1.2 Оптимизация условий постановки ПЦР
4.1.3 Конструирование рекомбинантного контроля амплификации к тест-системе для выявления генома вируса болезни Шмалленберг методом ОТ-ПЦР в реальном времени
4.1.4 Подбор внутреннего контроля к тест-системе для выявления генома вируса болезни Шмалленберг методом ОТ-ПЦР в реальном времени
4.1.5 Определение специфичности и чувствительности метода ПЦР
4.2 Разработка тест-системы для выявления геномов вирусов болезней Шмалленберг и Акабане методом мультиплексной ОТ-ПЦР в режиме реального времени
4.2.1 Подбор праймеров
4.2.2 Оптимизация реакции обратной транскрипции
4.2.3 Оптимизация условий постановки ПЦР

исследований был сделан вывод о существовании третьего пути распространения вируса - через инфицированную сперму [127].
Не следует исключать и четвертый путь заражения - ятрогенный, то есть ветеринарными специалистами при проведении ветеринарно - профилактических (вакцинации, химиотерапевтические обработки, подкожные, внутримышечные инъекции и т.д.) и диагностических мероприятий (взятии крови, соскобов).
Прямая передача вируса БШ от животного к животному не доказана. Также еще не выявлены другие возможные способы передачи вируса болезни Шмалленберг [80, 109].
В настоящее время болезнь быстро распространяется по Европе и уже установлена более чем в двадцати странах (рисунок 7) [11, 43, 66, 80, 96, 106, 109, 138].
Рисунок 7 — Распространение болезни Шмалленберг в странах Европы: 1 — Германия, 2 - Великобритания, 3 — Франция, 4 - Испания, 5 — Италия, 6 — Австрия, 7 — Дания, 8- Голландия, 9-Бельгия, 10 - Люксембург, 11 - Швейцария, 12-Швеция, 13-Польша, 14 - Финляндия, 15-Ирландия, 16-Эстония, 17 - Норвегия, 18-Россия, 19-Сербия, 20 - Румыния, 21 - Словения, 22 - Чехия, 23 - Венгрия, 24 - Казахстан