Биотехнологические аспекты разработки иммуноанализа для диагностики хламидиоза овец

• Автор: Полянина, Татьяна Ивановна
• Шифр специальности: 03.01.06, 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 206 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ПРИНЦИПЫ КОНСТРУИРОВАНИЯ ИММУНОАНАЛИЗА

ГЛАВА 2. ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ ХЛАМИДИОЗА

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 3. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Биомодели для получения препаративного количества специфических хламидийных антител

3.2. Клинический материал от овец

3.3. Антигены
3.4. Методы получения специфических хламидийных антител (иммуноглобулинов)
3.4.1. Иммунизация биомоделей
3.4.2. Получение и выделение специфических иммуноглобулинов из иммуноасцитической жидкости мышей и сыворотки крови кроликов
3.4.3. Определение чистоты выделенных иммуноглобулинов.
3.5. Методы изучения диагностической значимости полученных хламидийных антител и сконструированных на их основе экспериментальных вариантов иммуноанализа для выявления возбудителя хламидиоза овец
3.5.1. Определение титра полученных мышиных и кроличьих хламидийных антител
3.5.2. Определение диагностической значимости экспериментальных хламидийных антител
3.5.3. Бактериоскопические исследования клинического материала от овец
3.6. Методы приготовления конъюгата антихламидийных иммуноглобулинов с коллоидным золотом
3.6.1. Получение раствора коллоидного золота
3.6.2. Определение «золотого числа»
3.6.3. Конъюгирование антихламидийных
иммуноглобулинов с наночастицами коллоидного золота

3.6.4. Концентрирование иммунозолотого конъюгата
3.7. Молекулярно-генетические методы
3.7.1. Выделение ДНК из клинического материала от овец
3.7.2. Проведение ПЦР-амплификации
3.7.3. Детекция продуктов ПЦР-амплификации
3.8. Оборудование, материалы и реактивы
3.8.1. Оборудование
3.8.2. Основные материалы
3.8.3. Реактивы и растворы
3.9. Статистические методы и компьютерная обработка результатов
ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ХЛАМИДИЙНЫХ АНТИТЕЛ КАК ОСНОВЫ ИММУНОТЕСТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ХЛАМИДИОЗА ОВЕЦ
4.1. Оптимизация получения специфических антител к стандартному орнитозному антигену C. psittaci («С-аг-1») с использованием в качестве биопродуцентов кроликов и инбредных мышей
4.1.1. Получение специфических кроличьих антител к стандартному орнитозному антигену С. psittaci («С-аг-1»).
4.1.2. Получение специфических мышиных антител к стандартному орнитозному антигену С. psittaci («С-аг-1»).
4.2. Оптимизация получения мышиных специфических антител
к комбинации антигенов к С. trachomatis и С. psittaci («С-аг-2»),
4.3. Получение препаративного количества специфических хламидийных антител, выделение и оптимизация способов хранения иммуноглобулиновой фракции
4.4. Изучение диагностической значимости отдельных экспериментальных серий моноспецифических хламидийных антител с использованием расширенной панели клинических образцов от овец
ГЛАВА 5. КОНСТРУИРОВАНИЕ И АПРОБАЦИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ИММУНОАНАЛИЗА ДЛЯ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ ХЛАМИДИОЗА ОВЕЦ
5.1. Приготовление конъюгата моноспецифических антихламидийных иммуноглобулинов и коллоидного золота с диаметром наночастиц 20 и 40 нм
5.2. Конструирование вариантов ДИА на основе экспериментальных серий иммунозолотых конъюгатов «Ig

Au20», «Ig4-Au40», «Igl5-Au20» и «Igl5-Au40»
5.2.1. Изучение влияния способов инкубирования НЦМ с нанесенными клиническими образцами в иммунозолотом конъюгате на результаты иммунотеста
5.2.2. Изучение влияния твердой фазы на результаты иммуноанализа
5.2.3. Изучение влияния способов фиксации клинического материала на твердой фазе при постановке ДИА с использованием экспериментальных серий иммунозолотого конъюгата на количество ложноотрицательных и ложноположительных ответов
5.2.4. Оптимизация интенсивности цветного сигнала в ДИА путем концентрирования иммунозолотых конъюгатов.
5.2.5. Изучение влияния способов блокировки свободных сайтов НЦМ на результаты ДИА
5.2.6 Изучение диагностической значимости и апробация экспериментального ДИА40/15 на клинических образцах от овец
5.3. Конструирование экспериментального варианта иммунохроматографического анализа с использованием «Ig4-Аи20», «Ig4-Au40», «Igl5-Au20» и «Igl5-Au40»
5.3.1. Подбор аналитических мембран для оптимизации активности иммунозолотого конъюгата и изучения эффективности формирования цветного сигнала
5.3.2. Сравнительное изучение методов фиксации иммуноглобулинов на аналитической мембране
5.3.3. Изучение влияния блокировки свободных сайтов аналитической мембраны на визуализацию результатов иммунохроматографического анализа
5.3.4. Выбор мембран для фиксации иммунозолотого конъюгата
5.3.5. Изучение влияния тест-буферов на эффективность индикации возбудителя хламидиоза овец
иммунохромато графической тест-системой
5.3.6 Изучение диагностической значимости и апробация экспериментального варианта иммунохроматографической тест-системы на клинических образцах от овец
ГЛАВА 6. РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ ВАЛИДАЦИИ ИММУНОТЕСТОВ ДЛЯ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ ХЛАМИДИОЗА ОВЕЦ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СОВРЕМЕННЫХ
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ
6.1. Выявление ДНК С. trachomatis в клиническом материале от овец с применением коммерческих ПЦР тест-систем

люминесценцию природных или генно-инженерных микроорганизмов. В последние годы наиболее активно развивается направление по созданию биосенсоров оптического типа, работа которых основана на плазмонном резонансе (Keane et al., 2002; Belkin, 2003; Gu et al., 2004; Ron, 2007; Дыкман и др., 2008; Понаморева, 2010). Аналитическим сигналом в указанных биосенсорах является изменение интенсивности свечения микроорганизмов. В биораспознающих элементах биосенсоров используют как нативные, так и рекомбинантные штаммы бактерий (Belkin, 2003; Keane et al., 2002) В иммуносенсорах на твердой фазе сорбируют специфические молекулы (Ig, антигены). На одной платформе может быть нанесено большое количество Ig, специфичных к различным антигенам. Каждый такой чип, теоретически, позволит проводить массовые скрининговые обследования одновременно на несколько этиологических факторов инфекционных и соматических болезней человека и животных. На практике проведение подобного анализа требует больших материальных затрат, поэтому в настоящее время нет возможности проводить такие скрининговые обследования поголовья скота в РФ (Варфоломеев, 1997; Пальцев, 2009; Гнеденко и др., 2010).
В 2013 году появились сведения о разработке нового метода детекции -иммуно-ПЦР, которая сочетала в себе универсальность ИФА со специфичностью и чувствительностью ПЦР. Сообщалось, что при помощи иммуно-ПЦР возможно обнаружение патогенного прионного белка с использованием специфических антител, меченных двухцепочечной ДНК (маркер). Проведение ПЦР многократно увеличивало специфический участок нуклеотидной последовательности, что существенно повышало чувствительность метода. Указанный метод иммуно-ПЦР включал стадии иммобилизации антигена, затем связывания антигена с биотилированным антителом, взаимодействия биотилированного антитела со стрептавидиновым комплексом (комплекс стрептавидин - биотин - ДНК-мишень), а затем проведения ПЦР в реальном времени с использованием флуоресцентного зонда. При этом, например, для детекции инфекционной губчатой