Анализ переноса агробактериальной Т-ДНК в генеративные клетки кукурузы

• Автор: Моисеева, Елизавета Михайловна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 126 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Общая характеристика основных методов генетической трансформации растений

1.1.1 Методы прямого переноса ДНК в клетки растений

1.1.2 Методы непрямого переноса ДНК в клетки растений

1.2 Аргобактериальная трансформация растений

1.2.1 Общая характеристика процесса агробактериальной трансформации растений

1.2.2 Функциональная организация Ti-плазмид

1.2.3 Процесс агробактериальной трансформации
1.2.4 Векторы для агробактериальной трансформации растений
1.2.5 Агробактериальная трансформация in vitro
1.2.6 Агробактериальная трансформация in planta
1.2.7 Факторы, влияющие на эффективность
аргобактериальной трансформации
1.3 Практическое и фундаментальное значение генетической трансформации растений
1.4 Проблемы генетической трансформации растений
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 3
2. 1 Материалы
2.1.1 Использованные штаммы A. tumefaciens
2.1.2 Среды
2.1.2.1 Среды для культивирования A. tumefaciens
2.1.2.2 Среда для проращивания пыльцы
2.1.2.3 Инокуляционные среды
2.1.2.4 Среды для выращивания растений
2.1.3 Растения
2. 2 Методы
2.2.1 Агробактериальная трансформация растений
2.2.1.1 Приготовление суспензии бактериальных клеток
2.2.1.2 Обработка растений агробактериальной суспензией
2.2.1.3 Отбор трансформантов
2.2.1.4 Выделение тотальной ДНК растений
2.2.1.5 Выделение тотальной ДНК агробактерий
2.2.1.6 ПЦР-анализ
2.2.1.7 Электрофорез
2.2.1.8 Обработка данных
2.2.2 Определение плоидности у растений кукурузы
2.2.3 Выявление присутствия агробактериальной ДНК в растительном материале
2.2.4 Определение активности (3-глюкуронидазы в листьях проростков кукурузы после трансформации
2.2.5 Определение экспрессии гена gfp в корнях проростков после трансформации
2.2.6 Определение содержания свободного пролина в тканях кукурузы
2.2.7 Трансформация пыльцевых зерен кукурузы in vitro ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
3.1 Влияние различных факторов на частоту
агробактериальной трансформации кукурузы в условиях in planta
3.1.1 Частота трансформации кукурузы в условиях in planta при различной температуре
3.1.2 Зависимость частоты трансформации от способа инокуляции кукурузы Л. tumefaciens „
3.1.2.1 Частота встройки Т-ДНК в геном кукурузы при различных способах нанесения суспензии агробактерий

3.1.2.2 Частота встройки Т-ДНК в геном кукурузы при разных вариантах нанесения пыльцы и суспензии А. Ытефаыет на пестичные
нити кукурузы
3.1.3 Анализ растительного материала на наличие агробактериальной ДНК
3.2 Трансформация пыльцевых зерен кукурузы
3.2.1 Трансформация пыльцевых зерен кукурузы in vitro
3.2.1.1 Трансформация пыльцевых зерен кукурузы in vitro штаммом
A. tumefaciens LBA4404, несущим векторную конструкцию с генами nptll и gus-intron
3.2.1.2 Трансформация пыльцевых зерен кукурузы in vitro штаммом
A. tumefaciens AGL0, несущим векторную конструкцию с генами
nptll и gfp
3.2.2 Трансформация пыльцевых зерен кукурузы в условиях
in planta
3.3 Трансформация женского гаметофита кукурузы в условиях
in planta
3.4 Определение экспрессии генов, перенесенных в составе Т-ДНК,
в растениях кукурузы
3.4.1 Экспрессия гена nptll у растений кукурузы
3.4.2 Экспрессия гена gus-intron в листьях кукурузы
3.4.3 Экспрессия гена gfp в корнях кукурузы
3.4.4 Определение концентрации пролина у трансгенных растений кукурузы, несущих антисмысловую последовательность гена пролиндегидрогеназы
3.5 Анализ наследования встроек Т-ДНК у кукурузы
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

немаловажным фактором при трансформации арабидопсиса. Установлено, что наиболее оптимально 2-х минутное погружение цветочных почек в суспензию и 4-х минутное выдерживание под вакуумом (Викторэк-Смагур с соавт., 2009).
После встраивания 'Г-ДНК в растительные клетки очень важным моментом является правильный отбор трансформантов. Трансгены могут по-разному экспрессироваться в разных растениях, к тому же экспрессия зависит от типа промотора, под которым находится маркерный ген в переносимой конструкции.
При использовании маркерных генов необходимо учитывать особенности их экспрессии в различных условиях. Широко используемый при трансформации животных клеток ген зеленого флуоресцентного белка (GFP) обладает такими свойствами, как высокая стабильность, минимальная токсичность, неинвазивная детекция и способность генерировать флюорофор in vivo. Однако, многие компоненты растительных клеток (флавины, лигнин, хлорофилл) обладают собственной флуоресценцией на той же длине волны, что и GFP. Автофлуоресценция мешает визуализации экспрессии трансгена, сигнал GFP будет постоянно перекрываться эндогенной клеточной флуоресценцией или флуоресценцией среды.
Ранее считалось, что клетки растений не обладают эндогенной глюкуронидазной активностью. Однако многие ткани растений, не подвергавшихся трансформации, окрашивают субстрат X-Gluc в голубой цвет (Sudan, 2006). Эндогенная активность глюкуронидазы проявтяется при пониженном pH среды, поэтому важно доводить pH используемых буферов до 7-8 (Jefferson et al., 1987а; Sudan et al., 2006).
Обычно переносимые гены помещают под контроль конститутивного промотора, такого как 35 S промотор из вируса табачной мозаики, убиквитиновый промотор из кукурузы, промотор нопалинсинтетазы.