Разработка комплекса методов молекулярной диагностики парвовирусной инфекции свиней

• Автор: Елисеева, Олеся Васильевна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Щёлково
• Количество страниц: 115 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Список сокращений ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Классификация и общая характеристика семейства Рагуоуігійае
1.2. Парвовирусная инфекция свиней
1.2 Л. Характеристика возбудителя
1.2.2. Эпизоотологические особенности
1.2.3. Патогенез
1.2.4. Клинические признаки
1.2.5. Патологоанатомические изменения
1.3. Диагностика
1.3.1. Реакция торможения гемагглютинации
1.3.2. Реакция нейтрализации
1.3.3. Реакция диффузионной преципитации
1.3.4. Иммуноферментный анализ
1.3.5. Реакция гемагглютинации
1.3.6. Метод флуоресцирующих антител
1.3.7. Выделение
1.3.8. Молекулярные методы диагностики
1.3.8.1. Полимеразная цепная реакция
1.3.8.2. Полимеразная цепная реакция в реальном времени
1.4. Иммунитет, профилактика и меры борьбы
1.5. Заключение по обзору литературы
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы и методы исследований
2.1.1. Материалы исследований
2.1.1.1. Вирусы, клетки, среды
2.1.1.2. Исследуемые образцы
2.1.1.3. Химические реагенты, наборы для молекулярной биологии
2.1.1.4. Оборудование, приборы и расходные материалы
2.1.2. Методы исследований
2.1.2.1. Выделение вирусной ДНК
2.1.2.2. Проведение ПЦР для обнаружения ДНК парвовируса свиней
2.1.2.3. Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.1.2.4. Проведение ПЦР в реальном времени для определения ДНК парвовируса свиней
2.1.2.5. Проведение множественной ПЦР в реальном времени для определения ДНК парвовируса свиней
2.1.2.6. Анализ результатов ПЦР в реальном времени
2.1.2.7. Конструирование рекомбинантной плазмиды 5 О
2.1.2.8. Определение массовой и молекулярной
концентрации рекомбинантных плазмид
2.1.2.9. Реакция гемагглютинации
2.1.2.1 Статистическая обработка результатов
2.2. Результаты исследований
2.2.1. Разработка тест - системы на основе ПЦР для выявления ДНК парвовируса свиней
2.2.1.1. Подбор праймеров и оптимизация условий
проведения ПЦР
2.2.1.2. Определение специфичности ПНР
тест-системы
2.2.1.3. Определение чувствительности ПЦР
тест-системы
2.2.1.4. Обнаружение парвовируса свиней в образцах от
животных с помощью разработанной ПЦР тест-системы
2.2.2. Разработка тест - системы на основе ПЦР в реальном времени для выявления ДНК парвовируса свиней
2.2.2.1. Подбор праймеров и оптимизация условий
проведения ПЦР в реальном времени
22.2.2. Определение чувствительности и специфичности
ПЦР тест-системы в реальном времени
2.2.2.3. Обнаружение ПВО в образцах от животных с
помощью разработанной тест-системы
2.2.2.4. Сравнительный анализ разработанных тест-систем
на основе ПЦР, ПЦР в реальном времени и метода РГА
2.2.3. Разработка диагностического теста на основе множественной ПЦР в реальном времени
для выявления и дифференцирования парвовируса свиней и цирковируса свиней 2 типа
2.2.3.1. Оптимизация условий проведения множественной
ПЦР в реальном времени
2.2.3.2. Определение чувствительности разработанной
тест-системы
2.2.4. Конструирование рекомбинантных плазмид
3. ОБСУЖДЕНИЕ
4. ВЫВОДЫ
5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
6. ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
dNTPs дезоксирибонуклеозидтрифосфаты
А аденин
Т тимин
Г гуанидин
Ц цитозин
LB питательная среда Лурия - Бертани
NSI, NS2, NS3 неструктурные белки VP1,VP2,VP3 структурные белки ГАЕ гемагглютинирующая единица
ДНК дезоксиробонуклеиновая кислота
ИФА иммуноферментный анализ
КРС крупный рогатый скот
КЧС классическая чума свиней
МФА метод флуоресцирующих антител
ОЕ оптические единицы
ПВИС парвовирусная инфекция свиней
ПВС парвовирус свиней
ППЭС перевиваемая линия клеток почки эмбрионов свиньи
ПЦР полимеразная цепная реакция
РГ А реакция гемагглютинации
РДП реакция диффузионной преципитации
PH реакция нейтрализации
РРСС репродуктивно-респираторный синдром свиней
РТГА реакция торможения гемагглютинации
СПМИ синдром послеотъёмного мультисистемного истощения
СЭК сыворотка эмбрионов коровы
ТИД5о/Мл доза, инфицирующая 50% культуры клеток
ФБР фосфатный солевой буферный раствор
ЦВС-2 цирковирус свиней 2 -го типа

красителей. Большинство флуорофоров представляют собой гетероциклические и полиароматические углеводороды. Они поглощают свет одной длины волны и испускают свет другой, большей, длины волны. Существует два основных метода флуоресцентного определения продукта амплификации:
1. Применение дуплекс - специфичных интеркалирующих красителей, неспецифически связывающихся с ДНК;
2. Использование флуоресцентно - меченных олигонуклеотидных проб, комплементарных соответствующему участку продукта ПЦР.
Интеркалирующие красители связываются только с двухцепочечной молекулой ДНК, при этом интенсивность флуоресценции возрастает. В процессе денатурации краситель отделяется от цепи ДНК и уровень флуоресценции резко снижается. На стадии полимеризации краситель снова начинает связываться с продуктами ПЦР. После окончания полимеризации он полностью связывается с ДНК, что приводит к резкому возрастанию уровня флуоресценции. Таким образом, измерение флуоресценции в конце этапа полимеризации каждого цикла ПЦР позволяет оценить увеличение количества амплифицированной ДНК. Такие неспецифические красители универсальны, их можно использовать для постановки ПЦР с высокой чувствительностью. Наиболее известным и широко используемым красителем является SYBR Green I [65,86, 112].
Совершенствование методов флуоресцентной детекции привело к созданию флуоресцентно - меченных олигонуклеотидных проб (флуоресцентных зондов). Для большинства зондов существуют соединения -гасители, молекулы которых, находясь в непосредственной близости с ними, значительно снижают уровень их флуоресценции. Они перехватывают на себя энергию излучения от флуорофора. Различают два основных типа гасителей -флуоресцирующие и «темновые». В первом случае переданная гасителю энергия излучается в виде света, отличающегося от свечения свободного от гасителя флуорофора, а во втором - рассеивается в виде тепла, т.е. свечение отсутствует. Эффект гашения резко снижается при увеличении расстояния