Гибридные белки и конъюгаты на основе люциферазы светляков Luciola mingrelica и их биоаналитическое применение

• Автор: Смирнова, Дарья Васильевна
• Шифр специальности: 03.01.04, 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 140 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Люцифсрин-люцифсразная система светляков и ее биоаналитических применение

2.1.1. Применение люциферазы в методах анализа, основанных на детекции ее субстратов (АТР и люциферин)
2.1.2. Применение люциферазы в методах анализа, основанных на ее детекции как маркера
2.2. Методы получения бифункциональных молекул на основе люциферазы и фотопротеинов

2.2.1. Методы химической конъюгации. Основные подходы

2.2.2. Химически полученные конъюгаты на основе люцифераз и фотопротеинов.

2.2.3. Методы генетической инженерии по созданию гибридных белков на основе люциферазы
2.2.4. Гибридные белки, полученные на основе люцифераз светляков
2.3. Применение конъюгатов и гибридных белков на основе люциферазы светляков в бноспсцифнческом анализе
2.3.1. Применение конъюгатов и гибридных белков на основе люциферазы светляков в гетерогенном ИФА
2.3.2. Применение гибридных белков на основе люциферазы светляков для определения ДНК или РНК
2.4. Бноаналитичсские системы на основе биолюминесцентного резонансного переноса энергии (ВПЕТ) с использованием люциферазы
2.4.1. Основные принципы В RET
2.4.2. BRET-системы на основе Renilla люциферазы
2.4.3. BRET-системы на основе люциферазы светляков
2.4.4. Аналитическое применение BRET на основе люциферазы
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1. Вещества и реагенты

3.2. Штаммы и плазмиды
3.3. Аппаратура
3.4. Методики проведения экспериментов
3.4.1. Методы работы с ДНК
3.4.2. Конструирование плазмид
3.4.3. Получение гибридных белков Luc-bccp, Luc-SA и термостабильной люциферазы L.
mingrelica, содержащих РЕяй-последовательность
3.4.4. Изучение свойств гибридных белков Luc-bccp, Luc-SA
3.4.5. Применение гибридных белков Luc-bccp и Luc-SA в иммуноферментном анализе
для детекции клеток Salmonella
3.4.6. Применение гибридного белка Luc-SA для детекции биотинилированной ДНК клеток E. coli
3.4.7. Иммуноанализ прогестерона на основе биолюминесцентного резонансного переноса энергии (BRET) с использованием люциферазы светляков Luciola mingrelica
3.4.8. Гетерогенный конкурентный иммуноанализ прогестерона с использованием
биолюминесцентного метода детекции
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Получение и свойства гибридного белка люциферазы с биотинсвязывающим доменом (beep)
4.1.1. Конструирование плазмиды
4.1.2. Свойства гибридного белка люцифераза-Ьсср
4.2. Получение и свойства гибридных белков люциферазы со стрсптавндином
4.2.1. Конструирование плазмид
4.2.2. Получение гибридных белков люцифераза-стрептавидин
4.2.3. Свойства гибридных белков люцифераза-стрептавидин
4.3.Применеиие гибридных белков Luc-SA и Luc-bccp в биоспецифическом анализе

4.3.1. Специфическая детекция клеток Salmonella с использованием гибридных белков Luc-bccp и Luc-SA

4.3.2. Гибридизациошіьгй анализ ДНК с использованием гибридного белка Luc-SA
4.4. Иммуноанализ прогестерона на основе биолюминесцентного резонансного переноса
энергии (BRET) с использованием люциферазы светляков Luciola mingrelica
4.4.1. Конструирование системы для эффективного BRET
4.4.2. Получение и свойства конъюгатов люцифераза-прогестерон
4.4.3. Получение и свойства конъюгатов антитело-краситель
4.4.4. Оптимизация условий регистрации BRET-сигнала и анализа прогестерона
4.4.5. Гетерогенный иммуноанализ прогестерона с использованием биолюминесцентного метода детекции
5. ВЫВОДЫ
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

полученных при использовании различных методов. Использование магнитных частиц значительно сокращает время проведения анализа. Стоит отметить, что в работах [119], [132] использование двух биотинилированных люцифераз, излучающих в различных областях спектра позволило провести одновременное определение концентрации двух аналитов в одной смеси с использованием соответствующих фильтров, что открывает возможности использования люцифераз в мультиплексном анализе.
Таблица 6. Использование биотииилированной люциферазы в комплексе со стрептавидином в
гетерогенном ИФА
Метод Детектирующий комплекс Антиген Время анализа Диапазон определяемых концентраций Ссыл- ка
Конкурента ый ИФА на магн. ч в- эквол- -8А-Ь-Ьсср-Ьис Эквол (фито эстроген) 45 мин 960-3700 нМ [131]
2-х стадийный сэндвич ИФА на планшете АЬ-Ь-8А-Ь- Акворин Альфафето- протеин 1,5 ч 0,15-1500 пМ [68]
СурпсИпа-Ъ- 5А а-интерферон 3,5 ч 0,4-25 пМ [76]
НІІР -АЬ а-интерферон 3,5 ч 1,25-50 пМ [76]
Одностадий ныи сэндвич ИФА Рис. 7В Тиреотропный гормон 15 мин 0,0025-200 м кед./мл [134]
АЬ-8А- Ь-Ьис Тропоннн 15 мин 0,25-8 пМ [75]
АЬ-Ьис Креатинкиназа 15 мин 0,07-1,2 иМ [75]
2-х стадийный сэндвич ИФА на магнитных частицах Рис. 7А РО I и РИ И 15 мин 0,05-5 нМ РО I, 0,025-2,5 нМ Рв II [П9], [132]
Рис. 7В ПСА 15 мин 0.01 пМ- 3,6 нМ [133]
Рис. 7С Вирусный антиген гепатита В 30 мин 0,0025-125 ед/мл [136]
ИКР -АЬ 1,5 ч 12,5 мед/мл [136]
Рис. 7С Капсидный антиген норовируса 30 мин 0,25-10000 пкг/мл, 7,1 х 105 копий/г, 1,5 х 104 частиц/мл [135]
ИФА на планшете НЯР -АЬ Капсидный антиген норовируса 1,5 ч 106-107 копий/г [140]
Иммунохро матография НЯР -АЬ 20 мин 4.5 х Ю6 копий/мл [137, 1
Обозначения: Н11Р - пероксидаза хрена, Ь - биотин, РО I и Рв II - сывороточный пспсиногсн I и II типов, ПСА- простатаспецифичный антиген.
Особенно стоит отметить использование биотииилированной люциферазы для специфического определения патогенных микроорганизмов в суспензии клеток, основанного на детекции их антигенов (белок А, белок С [142], липополисахариды [143] и др.) с использованием гетерогенного иммуноанализа, и для дифференциации штаммов, устойчивых и восприимчивых к действию антибиотиков. В качестве примера можно привести