Механизмы токсического действия бета-амилоидных пептидов на эритроциты и клетки мозга

• Автор: Соломадин, Илья Николаевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 99 с. : ил.

Список принятых в тексте работы сокращений.

АРР - белок предшественник амилоида

Aß - бета-амилоидный пептид

АКМ - активные кислородсодержащие метаболиты

АТФ - аденозинтрифосфат

БА - болезнь Альцгеймера

СОД - супероксиддисмутаза

1. Введение

2. Амилоидные пептиды

2.1.1. История открытия, амилоидозы, болезнь Альцгеймера

2.1.2. Состав и свойства бета-амилоидных пептидов
2.1.3. АРР: образование и возможная роль в организме
2.1.3.1. АРР: транскрипция и трансляция
2.1.3.2. Протеолитические превращения АРР
2.1.3.3. Строение и свойства у-секретазы
2.1.3.4. Свойства бета-амилоидных пептидов
2.1.3.5. Механизмы токсического действия
бета-амилоидных пептидов
2.2. Модели для изучения токсического действия Ар
3. Цели и задачи работы
4. Материалы и методы исследования
4.1. Реактивы
4.2. Животные
4.3. Приготовление препарата синтетического бета-амилоидного пептида, (АР) фрагмент
4.4.Введение (Ар) фрагмента 25-35 посредством стереотаксических операций
4.5.Выделение различных отделов из мозга крыс
4.6.Получение митохондрий из различных отделов мозга крыс
4.7.Выделение и очистка эритроцитов
4.8.Лизис эритроцитов
4.9.Получение кислотных экстрактов из эритроцитов
4.10. Получение и очистка мембран эритроцитов
4.11. Исследование морфологии эритроцитов с помощью оптического > микроскопа
4.12. Определение активности ферментов

4.12.1. Лактатдегидрогеназа (КФ 1.1.1.27)(ЛДГ)
4.12.2. Каталаза (КФ 1.11.1.6)
4.12.3. Супероксиддисмутаза (СОД)(КФ 1.15.1.1)
4.12.4. Глутатионредуктаза (КФ 1.6.4.2)
4.12.5. Глутатионпероксидаза (КФ 1.11.1.9)
4.12.6. Ыа+/К+-АТФ аза. (КФ3.6.3.9)
4.12.7. Глутаминсинтетаза (КФ 6.3.1.2)
4.12.8. Аспартатаминотрансфераза (КФ 2.6.1.1)
4.12.9. Фосфофруктокиназа (КФ 2.7.1.11)
4.12.10. Определение содержания окисленного и восстановленного глутатиона в эритроцитах
4.13. Определение содержания окисленного и восстановленного глутатиона в эритроцитах
4.14. Анализ асимметрии фосфолипидов мембран эритроцитов
4.15. Определение концентрации АТФ в эритроцитах
5. Результаты и обсуждение.
5.1. Влияние Ар 25-35 на активность ферментов-антиоксидантов
в разных отделах мозга старых крыс in vivo

5.2. Глутаминсинтетаза, возможный вклад в токсическое действие Ар.

5.3. Токсическое действие Ар пептидов на эритроциты:
5.3.1. Изменения формы эритроцитов
5.3.2. Нарушение ионного баланса в эритроците,

измерение активности Ка+/К+-АТФазы
5.3.3. Метаболизм эритроцита при действии Ар,

ферменты гликолиза и пентозофосфатного пути

530нм). Пробу для позитивного контроля готовили следующим образом: осадок эритроцитов инкубировали ЗО минут с ЮмМ н-этилмалеимидом (NEM) при температуре 25°С, отмывали PBS, инкубировали суспензию 1 час 37°С с Са2+-ионофором А23187, затем клетки отмывали PBS с добавлением 2,5 мМ Na-ЭДТА и три раза промывали PBS, содержащим 1% бычьего сывороточного альбумина. Затем проводили те же действия, как после инкубации эритроцитов с бета-амилоидным пептидом. Для негативного контроля в пробу вносили Na-ЭДТА до конечной концентрации 2мМ перед добавлением Fitz-Annexin V. Дальнейшие процедуры те же, что и описанные выше.
4.15 Определение концентрации АТФ в эритроцитах
Для получения экстракта эритроцитов после инкубации с бета-амилоидным пептидом суспензию клеток центрифугировали 4 минуты 1500g, при +4°С. Надосадочную жидкость удаляли, из осадка эритроцитов отбирали 5 мкл и добавляли в 955мкл 3% раствора NaCl после чего проводили подсчет клеток. Из оставшегося осадка отбирали 10 мкл эритроцитов и добавляли к ним ЮОмкл. 6% раствора НСЮ4 в 40% спирте. Центрифугировали при 7000g, при +4°С. Осадок отбрасывали, в надосадочной жидкости доводили pH до величины 6 используя 30% охлажденный раствор КОН и кристаллы КНС03 . Осадок КСЮ4 осаждали центрифугированием при том же режиме. В надосадочной жидкости определяли содержание АТФ, АДФ. Концентрацию АТФ определяли по увеличению флуоресценции при образовании НАДФН при25°С Реакционная среда состояла из буфера, содержащего 90мМ КС1, 20мМ трис, 5мМ MgCl2, pH 7,5, в который добавляли НАДФ до конечной концентрации 0,15мМ, смесь гексокиназы и глюкозы, и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу.