Магнитные изотопные эффекты 25Mg и 67Zn в регуляции каталитической активности фосфатидилтрансфераз

• Автор: Орлов, Алексей Павлович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 101 с. : ил.

Содержание
I ВВЕДЕНИЕ
II ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
2.1. Магнитный Изотопный Эффект
2.1.1. История открытия эффекта
2.1.2. Проявление МИЭ в биологических системах
2.2. Современные представления о биологической функции магния и 16 цинка.
2.2.1. Биологическая роль магния в организме.
2.2.2. Клеточный гомеостаз магния
2.2.3. Биологическая роль цинка в организме.
2.2.4. Цинк и апоптоз.
2.2.5. Цинк-ДНК-полимеразы-апоптоз.
2.2.6. Концентрационная зависимость влияния ионов цинка на
апоптоз.
2.2.7. Цинк и мозг.
2.2.8. Транспортеры цинка в организме.
2.3. Опыт фармакологического применения наночастиц.
2.3.1. Наночастицы в медицине.
2.3.2. Катионообменные наночастицы
III МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Активность креатинкиназы и пируваткиназы
3.2. Полимеразная цепная реакция
3.3. Выделение ДНК- полимеразы р
3.3.1. Культура клеток для выделения ДНК-полимеразы
3.3.2. Выделение хроматина
3.3.3. Гель-фильтрация
3.4. Электрофорез
3.4.1. Электрофорез белка
3.4.2. Электрофорез ДНК
3.4.3. Изоэлектрическое фокусирование белков
3.4.4. Измерение активности ДНК-полимеразы

3.5. Спектрофотометрия
3.6. Работа с культурой клеток острого миелоидного лейкоза человека
3.6.1. Клетки
3.6.2. Получение материала
3.6.3. Выделение мононуклеарных клеток из КМ пациентов с ОЛЛ и 41 периферической крови здоровых доноров (стандартная методика)
3.6.4. Наночастицы РМС16
3.6.5. МТТ - тест
3.6.6. Опенка индукции апоптоза
3.6.7. Статистическая обработка полученных результатов
IV РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Цинк-зависимый магнитный изотопный эффект в ферментативном
синтезе АТФ
4.2. Магнитный изотопный эффект в ПЦР
4.3. Выделение и очистка ДНК-полимеразы р из клеток миелоидного
лейкоза человека
4.4. Магнитные изотопные эффекты в регуляции активности ДНК-
полимеразы р
4.5. Влияние магнитного поля на синтез ДНК
4.6. Ион-радикальный механизм в синтезе ДНК
4.7. Влияние магнитного изотопного эффекта на выживаемость клеток

4.7.1. Результаты МТТ - теста
4.7.2. Результаты оценки индукции апоптоза
V ЗАКЛЮЧЕНИЕ
VI ВЫВОДЫ
VII СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

I. ВВЕДЕНИЕ.
Синтез АТФ является одним из главнейших процессов, регулирующих функционирование человеческого организма, поэтому к его особенностям и нарушениям приковано пристальное внимание ученых. Другим столь же важным объектом является генетическая основа организма, т.е. синтез ДНК. Последние исследования открыли новую страницу, подтвердив более ранние представления биофизиков и, в частности, Л.А.Блюменфельда [1] о том, что ферменты, осуществляющие биохимию клетки в нашем организме, представляют собой молекулярные машины. Магнитный изотопный эффект дает новое понимание работы этой машины, открывая дополнительный канал, роль которого в эволюции и патогенезе заболеваний пока неясен. Однако очевидно, что такие понятия как энергетические запреты и энергетическая память [2] приобретают новый, можно сказать, «спиновый» смысл.
В связи с этим возникает проблема, во-первых, влияния магнитных изотопов (и более всего тех, которые в некотором количестве, содержатся в нашем организме, при этом выполняя активную роль) на синтез ДНК и мутационные процессы. Во-вторых, возникает вопрос о взаимосвязи действия магнитных ядер на синтез АТФ и синтез ДНК. Количество неизвестных на этом поле исследований огромно, поэтому данная работа сконцентрирована на влиянии двух из важнейших микроэлементов, а именно, магния и цинка, на работу ДНК-полимераз. Это связано с тем, что цинк, входя в состав транскрипционных факторов «цинковые пальцы» активно участвует в синтезе ДНК, при этом 4% пула изотопов цинка занимает 67Zn, имеющий магнитное ядро. Количество магнитного 25Mg в его общем пуле еще больше и достигает -10%. Таким образом, данная работа делает первые шаги по направлению установления более общей картины о вкладе магнитных изотопов в работу молекулярных машин нашего организма.
Кроме экспериментов на чистых ферментах чрезвычайно интересной задачей было также обнаружение влияния магнитного изотопа на клетки in vitro. Современная медицина за последние 30 лет достигла больших успехов в лечении лейкозов. Детские лейкозы более благоприятны для лечения и прогноза, чем взрослые: успешно лечатся примерно 70-75% острых лимфобластных (OJIJI) и 30-50% острых нелимфобластных лейкозов. Уровень пятилетней выживаемости детей с ОЛЛ за последнее время вырос с 58% у детей, диагностированных в 1975-77 гг, до 87% у детей, диагностированных с 1996 по 2003 гг., а пятилетняя выживаемость у детей с острыми миелобластными лейкозами (ОМЛ) выросла с 19% до 54% соответственно. Неудовлетворительные результаты лечения отмечаются у больных с рецидивами, особенно ранними, и рефрактерными формами острых лейкозов. До

III. Материалы и методы.
3.1 Активность креатинкизы и пируваткиназы
Для проведения экспериментов использовался фермент креатинкиназа (ЕС 2.7.3.2), выделенный из лиофилизированного яда Vipera Xanthia и очищенный по методике, описанной в [143]. Фермент пируваткиназа из ретикулоцитов кролика (ЕС 2.6.9.17), был приобретен в, осажденной сульфатом аммония, форме в Worthington, Inc., Дюрхам. Субстраты, [лР]-фосфокреатин, 26,6-29.2 Ки мМ'1 и [32Р]-фосфоенолпируват, 33.6-37.4 Ки мМ'1 были изготовлены Радиохимическим Центром Amersham, Великобритания. Активность ферментов оценивалась, как количество распадов радиоактивного 32Р в минуту, посчитанных в отделенном с помощью ВЭЖХ пуле [32Р]-АТР, произведенного 1,0 мг чистого фермента в течение 40 мин инкубации время в образцах, свободных от ионов Mg2+/Ca2+ [13].
3.2. Полимеразная цепная реакция
Для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) был использован набор реагентов для амплификации фирмы СИНТОЛ, Россия (R-441), содержащий интеркалирующий краситель Eva-Green. В качестве действующего фермента в наборе использовалась термостабильная Taq-ДНК-полимераза с удельной активностью 5 E/mL. Магнитные изотопы 25Mg и 67Zn со степенью обогащения 86,6% и 97,8%, соответственно, были предоставлены компанией GaMMa Lab AG, Alicante, Spain, в виде оксидов MgO и ZnO. Вместо соли хлорида магния из набора мы использовали растворы солей магнитных и немагнитных изотопов 25р^ и 67£nj приготовленные с помощью обработки НС1 (Sigma Aldrich) вышеуказанных оксидов металлов. Итоговая концентрация стоковых растворов солей юстировалась с помощью метода атомно-адсорбционной спектрофотометрии на приборе ААА 610 (Carl Zeiss Jena). Реакция проводилась на амплификаторе BioRad IQ-5, для обработки данных использовалось стандартное программное обеспечение IQ-5. В качестве амплифицируемой матрицы применяли плазмиду Р28А с клонированной вставкой гена мышиного NGF (nerve growth factor). Нуклеотидные последовательности для праймеров были взяты из электронной базы данных PrimerBank [122] и синтезированы фирмой Синтол, Россия. Реакция включала в себя 30 циклов амплификации. Для подтверждения отсутствия контаминации, в каждом эксперименте присутствовал образец - нулевой контроль, без плазмиды.