Фибриллогенез бета-2-микроглобулина и иммунологические изменения при гемодиализном амилоидозе

• Автор: Поляков, Дмитрий Степанович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 162 с. : 12 ил.

Оглавление.
Введение

1. Обзор литературы

1.1. Общая характеристика и классификация амилоидозов

1.2. Молекулярно-биологические основы амилоидозов

1.3. Гемодиализный амилоидоз и бета2-микроглобулин

1.4. Структура бета2-микроглобулина и его функции в иммунной системе

1.4.1.Структура бета2-микроглобулина

1.4.2. Молекула класса I главного комплекса гистосовместимости

1.4.3. Неклассические молекулы главного комплекса гистосовместимости

1.5. Клинические проявления бета2-микроглобулинового амилоидоза

1.5.1. Синдром запястного канала
1.5.2. Амилоидная артропатия
1.5.3. Контрактуры сгибателей пальцев (атрофический тендосиновит)
1.5.4. Деструктивная спондилоартропатия
1.5.5. Костные кисты
1.5.6. Системные (висцеральные) амилоидные отложения
1.6. Диагностика бета2-микроглобулинового амилоидоза
1.7. Состав амилоидных отложений при бета2-микроглобулиновом амилоидозе
1.7.1. Бета2-микроглобулин — основной компонент амилоидных отложений при бета2-микроглобулиновом амилоидозе
1.7.2. Гликирование
1.7.3. Бета2-микроглобулин с усеченными аминокислотными последовательностями
1.7.4. Другие компоненты амилоидных отложений

1.8. Зеленые флуоресцентные белки в качестве маркеров фибриллогенеза
1.9. Особенности содержания цитокинов в плазме крови больных с хронической почечной недостаточностью
1.10. Заключение 66 .
2. Материалы и методы
2.1. Получение ß2M из ультрафильтрата больных, находящихся на хроническом гемодиализе
2.2. Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле
2.3. Окраска полиакриламидного геля Кумасси R-
2.4. Идентификация выделенного белка методом MALDI-TOF
2.5. Получение поликлональных антител кролика к бета2-микроглобулину человека
2.6. Выделение ДНК из замороженной крови
2.7. Полимеразная цепная реакция
2.8. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации в 8% полиакриламидном геле
2.9. Окрашивание полиакриламидного геля бромистым этидием
2.10. Окрашивание полиакриламидного геля нитратом серебра
2.11. Электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле
2.12. Выделение ДНК из агарозного геля
2.13. Получение компетентных клеток E. Coli
2.14. Лигирование
2.15. Трансформация компетентных клеток E. Coli
2.16. Выделение плазмидной ДНК из клеток E. Coli
2.17. Секвенирование ДНК
2.18. Создание экспрессионной генетической конструкции рЕТЬ2т6.8 для получения рекомбинантного полноразмерного бета2-микроглобулина человека
2.19. Создание экспрессионных генетических конструкций рЕТЪ2т1.1, РЕТЬ2т2.1
I 2.20. Создание экспрессионной генетической конструкции рТКСЬ2п^

I 2.21. Выделение и очистка рекомбинантного полноразмерного (32М
2.22. Выделение и очистка белка слияния |32М8Р
2.23. Выделение и очистка рекомбинантных (32МД6 и Р2МД
2.24. Формирование фибрилл Р2М
2.25. Измерение флуоресценции комплексов тиофлавина Т с фибриллами
2.26. Конфокальная микроскопия
2.27. Атомно-силовая микроскопия
2.28. Уез1егп-ВЕОТ
2.29. БоСВЕОТ
2.30. Иммобилизация Р2МД6 и рЗМЯБ на В гСЫ - акти вир о ванн ой Сефарозе
2.31. Исследование содержания цитокинов в плазме крови больных на
хроническом гемодиализе
3. Результаты и обсуждение
3.1. Получение Р2М из диализата больных на хроническом Еемодиализе
3.2. Получение рекомбинантного полноразмерного Р2М человека
3.3. Получение генетических конструкций, кодирующих укороченные варианты Р2М
3.4. Оптические свойства исходных препаратов Р2М и фибриллярных форм белка
3.5. Получение рекомбинантного белка слияния Р2М8Е
3.6. Гуморальный иммунный ответ на фибриллы Р2М
3.6.1. Деполимеризация «кислых» фибрилл Р2М в

молекул класса I главного комплекса гистосовместимости, располагающихся на поверхности мембран. Исключительная важность белка подтверждается отсутствием полиморфизма кодирующей части соответствующего гена. Нарушения структуры белка выявляются только при злокачественном перерождении клеток, что связано с участием нормального ß2M в антигенной презентации (Goldsby et al., 2007, Bjorkman et al., 1987).
ß2M синтезируется в количестве от 2 до 4 мг/кг в день, при этом период его полувыведения составляет 2,5 часа, а концентрация в плазме здоровых лиц - 1-3 мг/л. Так как элиминация ß2M на 95% обеспечивается путем клубочковой фильтрации (с последующей реабсорбцией и внутриклеточным протеолизом в проксимальных канальцах), его концентрация в плазме обратно пропорциональна скорости клубочковой фильтрации. Уровень ß2M у больных с хронической почечной недостаточностью многократно повышается, в зависимости от степени снижения функции почек, возрастая примерно в 60 раз вследствие значительного (в 10 —15 раз) увеличения периода полувыведения данного белка (Шило, Денисов 2002). Большие количества ß2M обнаруживаются в моче нефротических больных, у которых нарушена реабсорбция белка из первичного фильтрата. Такая моча обычно служит источником получения природного белка человека (Linke et al, 1989).
Проблема бета-2-микроглобулинового амилоидоза (Aß2M) связана с введением гемодиализа в медицинскую практику. При длительной гемодиализной терапии концентрация ß2M в плазме крови больных постоянно существенно превышает норму. Длительная персистенция высоких концентраций ß2M считается основной причиной появления молекул белка в аномальной конформации и образования амилоидных фибрилл (Maruyama et al, 1992). У некоторых из этих больных развивается осложнение гемодиализа, получившее название гемодиализного амилоидоза или Aß2M. По сути дела гемодиализный амилоидоз связан не с самой лечебной процедурой, а с устранением смертельных уремических состояний,