Конструирование белок-нуклеиновых комплексов для направленного транспорта в клетки чужеродной ДНК

• Автор: Татаринова, Ольга Николаевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 120 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1. Системы невирусной доставки экзогенной ДНК в клетки-мишени для генотерапии (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР)
1.1. Понятие «генотерапия»
1.2. Направленный транспорт чужеродной ДНК
1.3. Невирусная доставка ДНК в клетки
1.3.1. Химические методы доставки ДНК в клетки
1.3.2. Биохимические методы доставки ДНК в клетки
1.3.3. Адресная доставка ДНК в клетки с использованием
низкомолекулярных органических лигандов
1.3.4. Применение углеводсодержащих лигандов
1.3.5. Адресная доставка ДНК в клетки с использованием природных механизмов
1.3.6. Белковые и пептидные лиганды
1.3.6.1. Пептиды
1.3.6.2. Природные и рекомбинантные белки
1.3.6.3. Использование zinc finger proteins для генотерапии
1.4. Дизайн нуклеопротеиновых транспортных систем
1.4.1. ДНК-связывающие домены
1.4.2. Эндосомолитические домены
1.4.3. Ядерный импорт
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.1.1. Реактивы
2.1.2. Клеточные линии, бактериальные штаммы и плазмидные векторы
2.1.3. Белки и ферменты
2.1.4. Наночастицы никеля
2.2. Методы
2.2.1. Синтез олигонуклеотидов
2.2.2. Методы молекулярного клонирования
2.2.3. Полимеразная цепная реакция
2.2.4. Выделение рекомбинантных белков из биомассы
2.2.5. Очистка полипептидов
2.2.6. Культивирование клеток
2.2.7. Исследование эндоцитоза белок-нуклеиновых комплексов в клетках DU145 с помощью проточной цитофлуориметрии
2.2.8. Исследование эндоцитоза нуклеопротеиновых комплексов с помощью флуоресцентной микроскопии
2.2.9. Получение комплексов биополимеров с наночастицалш никеля
2.2.10. Дополнительное программное обеспечение
3. Конструирование белок-нуклеиновых комплексов для направленного транспорта в клетки чужеродной ДНК (ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ)
3.1. ДНК-компонента комплексов
3.1.1. Олигонуклеотиды, несущие тиофосфорильные модификации
3.1.2. Особенности хроматографии модифицированных олигонуклеотидов
3.2. Рекомбинантные белки для направленной доставки ДНК
3.2.1. Белковые векторы-переносчики ДНК
3.2.2. Структура рекомбинантных белковых переносчиков ДНК на основе фрагмента альфа-фетопротеина
3.2.3. Получение белков PGA, PGA1 и PGAl-His
3.2.4. Получение и исследование ассоциатов наночастиц никеля с олигонуклеотидами и гистидинтированными белками
3.2.5. Комплексы белков с олигонуклеотидами и плазмидной ДНК
3.2.6. Транспортные свойства белков PGA, PAG1 и PGAl-His
4. ВЫВОДЫ
5. СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
6. ПРИЛОЖЕНИЕ (Акт о внедрении разработок)
СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.
BHQ - Black hole quenchers GFP - зеленый флоресцирующий белок CPG - стеклянные шарики с контролируемым размером пор 3D - 3-й домен альфа-фетопротеина, отвечающий за связывание с рецепторами
DMSO - диметилсульфоксид DMTr - 4', 4"-диметокситритил EtBr - этидия бромид
FAM - 6-флуоресцеинил-6-карбоксиамидогексил IPTG - изопропилтио-Р-Б-галактозид
HEX - 4,7,2’,4’,5,,7’-гексахлор-флуоресцеинил-6-
карбоксиамидогексил
MALDI TOF MS - лазерная десорбционно-ионизационная время-пролетная масс-спектрометрия с участием матрицы
MFI - среднее значение интенсивности флуоресценции клеток NLS - сигнал ядерной локализации
PGEk - Protein Gen-carrier based on Epidermal Growth Factor
PCR (ПЦР) - полимеразная цепная реакция
PMSF - фенилметилсульфонилфторид
SD S -додецилсульфат натрия
АФП (AFP) - альфа-фетопротеин человека
БСА (В SA) - бычий сывороточный альбумин
ВЭЖХ (HPLC) - высокоэффективная жидкостная хроматография
НК - нуклеиновая кислота
ПААТ - полиакриламидный гель
Трис - трис-(гидроксиметил)аминометан
ФСБ (PBS) - фосфатно-солевой буфер
ЭФРч, EGFh - эпидермальный фактор роста человека.

Адресованность биохимических транспортных систем основана на различии в тканевом составе клеточных поверхностных рецепторов и антигенов или изменении их состава при заболевании. Интернализация генетического материала осуществляется в процессе рецептор-опосредованного эндоцитоза. Поэтому минимальная адресованная структура для доставки ДІЖ должна состоять из трансмембранного рецептороспецифичного домена и собственно ДНК-связывающего домена.
Поиск специфических лигандов - отдельная и далеко не простая задача, пути его только обозначены.
Эффективные избирательные невирусные системы, сконструированные для доставки в клетки-мишени, можно рассматривать как модифицированные лиганды к тканеспецифическим рецепторам или клеточным рецепторам. Основанную на таком же принципе аффинную пару составляют ДНК-связывающее производное антитела или его фрагментов и антиген на поверхности целевой клетки.
Формирование вектора может быть основано на непосредственном присоединении адресующего домена к олигонуклеотиду [90-93, 128, 129] или плазмидной ДНК химическими методами [130-134]. В таких случаях мы имеем, фактически, адресованные молекулы. Получение молекулярных конъюгатов белков с олигонуклеотидами и синтез олигонуклеотидо-пептидов рассматривается в ряде работ как перспективное направление [90-93, 128, 129]. Подобные гибриды имеют и ряд недостатков, как например отсутствие возможности высвобождения олигонуклеотида из