Исследование механизмов адаптации дрожжей Yarrowia lipolytica к росту при щелочных условиях pH внешней среды

• Автор: Гусева, Марина Александровна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 145 с. : ил.

Содержание
1. Введение
2. Обзор литературы
2.1 Введение
2.2 Транскрипционный фактор YlRimlOlp и его роль в механизме обеспечения алкалотолерантности дрожжей Y. lipolytica
2.2.1 Получение мутантов
2.2.2Фенотипические особенности мутантов
2.2.3 Отбор плазмид, обеспечивающих комплементацию мутаций PAL
2.2.4 Анализ последовательности гена Y. lipolytica, гомологичного RIMlOl/pacC
2.2.5 YIR1M101 не совпадает с генами, несущими мутации PALI, PAL2, PAL3 и PAL4
2.2.6 Экспрессия YIR1M101 зависит от pH и необходима для дерепрессии гена щелочной протеазы
2.2.7 Эффект С-концевой делеции YlRimlOlp на транскрипцию
2.2.8 Влияние мутаций PAL и YIR1M101 на рост, скрещивание и споруляцию
Обсуждение
2.3 Транскрипционный контроль гена щелочной протеазы XPR2 у Y lipolytica
2.4 Механизмы адаптации Y. lipolytica к щелочному стрессу на уровне система транспорта метаболитов на уровне плазматической мембраны
2.5 Протеомный анализ белкового состава дрожжей Y. lipolytica выращенных при щелочных значениях pH
2.6 Использование методов протеомики для изучения молекулярных основ адаптации S.
cerevisiae к солевому стрессу
2.6.1 Введение
2.6.2 Идентификация белков, реагирующих на солевой стресс, при повышении концентрации соли в митохондриях
2.6.3 Активация антиоксидантной защиты митохондрий при солевом стрессе
2.6.4 Регуляция накопления белков биосинтеза аминокислот при солевом стрессе

2.6.5 Вклад идентифицированных белков, индуцируемых при солевом стрессе, в механизм защиты клеток от окислительного и солевого стресса
2.6.6 Регуляция экспрессии генов белков внешней митохондриальной мембраны при солевом стрессе
2.6.7 Идентификация белков, содержание которых в митохондриях снижается в условиях солевого стресса
2.6.8 Регуляция синтеза ферментов гликолиза при солевом стрессе
Обсуждение
3. Материалы и методы
3.1 Методы поддержания культуры дрожжей Y. lipolytica
3.2 Определение протеолитической активности штаммов Y. lipolytica
3.2.1 Методика колориметрического определения содержания белка по модифицированному методу Лоури с бицинхониновой кислотой
3.3 Генноинженерное конструирование
3.3.1 Выделение плазмидпой ДНК (вариант минипреп)
3.3.2 Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля
3.3.3 Осаждение ДНК
3.3.4 Обработка ДНК рестриктазами
3.3.5 Постановка ПЦР
3.3.6 Электрофорез ДНК
3.3.7 Секвенирование ДНК
3.3.8 Поддержание штаммов E
3.3.9 Трансформация Д. coli плазмидными конструкциями
3.3.10 Создание конструкции pQE-URA3-HP4d-XPR
3.3.11 Введение конструкции pQE-URA3-HP4d-XPR в Y. lipolytica
3.4 Протеомные методы исследования
3.4.1 Одномерный денатурирующий электрофорез в ПААГ
3.4.2 Двумерный электрофорез по О’Фарреллу

3.4.3 Идентификация белков масс-спектрометрией
3.5 Метод ПЦР в реальном времени
3.5.1 Оптимизация метода выделения транскриптов из клеток дрожжей
3.5.2 Получение препаратов суммарной кДНК У. Иро1уИса для использования в ПЦР-РВ
4. Результаты и их обсуждение
4.1 Изучение экспрессии множественных генов щелочной протеазы у У.Иро1уИса
4.2 Изучение механизмов адаптации У.Иро1уИса к росту при щелочных условиях методами протеомики
Таблица 8. Первичные данные масс-спектроскопического исследования белков У. Иро1уИса РоН, уровень продукции которых изменяется при pH 8.5 по сравнению с pH
4.3 Изучение уровня экспрессии генов рН-индуцибельных белков У. ИрсИуИса с помощью ПЦР в реальном времени
4.3.1 Разработка системы праймеров и зондов для определения транскриптов потенциальных рН-реактивных генов У. Иро1уИса с помощью ПЦР в реальном времени
4.3.2 Разработка методики выделения суммарной РНК, получения кДНК и проведения измерений методом ПЦР в реальном времени
4.3.3 Исследования регуляции транскрипции потенциальных рН-реактивных генов
У. Иро1уНса с помощью ПЦР в реальном времени
5. Выводы
Литература

A. niger расС 23. Jacobs, 1992. GCCAAGAGG GCCAAGAGG GCCAGGATG
P. chrysogenum расС 43. Schuhetal, 1986 GCCAAGCGT GCCAAGCTT
P. chrysogenum рсЪАВ- рсЬС 43. Schuh et al, 1986 GCCAAGCGG* GCCAAGTCG6,c GCCAAGAACi,c
Консенсус GCCARGWSS
а Предполагаемые участки связывания YlRimlOlp по данным футпринтинга in vivo с использованием диметилсульфата.
b Предполагаемые участки связывания РасС по данным футпринтинга in vitro с использованием ДНКазы I.
с Полностью подтвержденные участки связывания РасС Подчеркнутые буквы соответствуют позициям, входящим в выведенный консенсус (Lamber et al., 1997): R -пурин, W - А или T, и S — С или G).
Как,было показано ранее с помощью ДНК-футприитинга, в пределах активаторного элемента UAS2 из промотора XPR2 Y lipolytica содержится десятичленная последовательность CGCCAAGACG, включающая шестичленный консенсус ДНК-мишени РасС. Это обстоятельство обеспечивает взаимодействие UAS2 гена Хрг с фактором РасС in vivo (Blanchin-Roland et al., 1994).
Более того, исследования работы UAS2 показали, что внесение десятичленного сайта распознавания YLRimlOlp в промотор гена LEU2 придают его экспрессии чувствительность к pH внешней среды (Madzak et al., 1999). Эти данные безусловно доказывают, что белки, связывающие десятичленный повтор, непосредственно активируют экспрессию содержащих их генов при щелочном pH внешней среды. Две копии описанного выше десятичленного,' повтора (один из них - с заменой G 39 на С) обнаруживаются в позициях 2168 и 2202 от старта начала транскрипции YIRIM101 (табл. 3).
Этот факт указывает на то, что pH-зависимая транскрипция YIR1M101 обладает способностью к авторегуляции подобно его гомологу расС из A. nidulans (Tilbum et al., 1995). Кроме того, установлено, что уровень экспрессии генов Y1RIM101 зависит от значения pH и наличия транскрипционно активных генов PAL (рис. 2 А). Интересно, что регуляторная область промотора гена АХР длиной 59 п.н. не содержит десятичленной