Ca2+-зависимые протеолитические ферменты некоторых водных беспозвоночных и рыб

• Автор: Канцерова, Надежда Павловна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Петрозаводск
• Количество страниц: 139 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Внутриклеточные Са2+-зависимые протеолитические ферменты

(система кальпаинов)

1.1.1. Общая характеристика внутриклеточных Са2+-зависимых

протеиназ животных

1.1.2. Внутриклеточные Са2+-зависимые протеиназы рыб

1.1.3. Внутриклеточные Са2+-зависимые протеиназы беспозвоночных

1.2. Роль внутриклеточных Са2+-зависимых протеолитических ферментов в становлении ответных реакций водных организмов при изменении некоторых факторов среды обитания

1.2.1. Биохимические адаптации

1.2.2. Роль внутриклеточных Са2+-зависимых протеолитических ферментов в механизмах эколого-биохимических адаптаций
1.3. Влияние загрязнения и сопутствующих факторов среды на водные организмы
1.3.1. Влияние нефти и нефтепродуктов на водные организмы
1.3.2. Влияние тяжелых металлов на водные организмы
1.3.3. Влияние промышленных сточных вод на водные организмы
Глава 2. Материал и методы исследований
2.1. Материал исследований
2.2. Методы исследований
2.2.1. Определение видовой принадлежности и возраста исследуемых организмов
2.2.2. Количественное определение тяжелых металлов в тканях исследуемых организмов
2.2.3. Экстракция протеиназ из тканей исследуемых организмов
2.2.4. Выделение и частичная очистка Са2+-зависимых протеолитических ферментов из тканей исследуемых организмов
2.2.5. Электрофорез в полиакриламидном деле

2.2.6. Определение активности Са2+-зависимых протеолитических ферментов
2.2.7. Количественное определение водорастворимого белка в тканях
2.2.8. Выделение тотальной РНК и синтез комплементарной ДНК
2.2.9. Проведение ПЦР в режиме реального времени
2.2.10. Статистическая обработка данных
Результаты и их обсуждение
Глава 3. Внутриклеточные Са2+-зависимые протеиназы некоторых водных беспозвоночных и рыб. Особенности структуры и свойств
3.1. Активность и видоспецифичность кальпаинов в тканях некоторых беспозвоночных и рыб
3.2. Выделение и частичная очистка внутриклеточных Са2+-зависимых протеиназ из тканей рыб. Распределение, тканевая специфичность и некоторые энзиматические свойства
3.3. Выделение и частичная очистка внутриклеточных Са2+-зависимых протеиназ беспозвоночных. Распределение и некоторые энзиматические
свойства
Глава 4. Влияние некоторых типов антропогенного загрязнения на внутриклеточные Са2+-зависимые протеолитические ферменты водных беспозвоночных и рыб
4.1. Внутриклеточные Са2+-зависимые протеиназы мидии МуШих ес1иИ$ Ь.
при воздействии нефтепродуктов в аквариальном эксперименте
4.2. Внутриклеточные Са2+-зависимые протеиназы мидии МуШиз ес1иШ Ь.
при воздействии солей меди и кадмия в аквариальном эксперименте
4.3. Влияние накопления стронция на внутриклеточные Са2+-зависимые протеиназы сига Со^опш кыагеХт Ь. из водоемов Мурманской области
4.4. Внутриклеточные Са2+-зависимые протеиназы рыб при минеральном
загрязнении водоемов стоками горно-обогатительного комбината
Заключение
Выводы
Список использованных сокращений
Список литературы

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. Протеолиз — ферментативный гидролиз пептидных связей в белках и пептидах — один из наиболее важных и универсальных химических процессов живой природы (Антонов, 1983; Kirschner, 2000). Актуальность изучения внутриклеточных протеиназ определяется, с одной стороны, их базовыми функциями в клетке, а с другой стороны - их ролью в развитии ответных реакций организма на действие разнообразных стресс-факторов, в том числе и факторов среды. Функции внутриклеточных протеолитических ферментов заключаются в деградации белков, а также в катализе реакций ограниченного протеолиза, необходимых для регуляции клеточного метаболизма. Последняя функция становится более очевидной с повышением эволюционной организации живых организмов (Степанов, 1994), и сегодня система Са2+-зависимого протеолиза, включающая Са2+-зависимые протеиназы семейства кальпаинов и их эндогенный ингибитор кальпастатин, рассматривается как одна из важнейших регуляторных систем клеток высших эукариот (Goll et al., 1990; Croall, DeMartino, 1991; Goll et al., 2003). Кальпаины (КФ 3.4.22.17; клан цистеиновых протеиназ СА, семейство С2) — Са2+-зависимые протеиназы, ответственные за селективную деградацию белков в цитозоле клеток всех организмов — от прокариот до человека. Они принимают участие в фундаментальных Са2+-зависимых клеточных процессах — передаче сигнала, клеточном цикле, пролиферации, дифференцировке, апоптозе, слиянии мембран, формировании мышечных волокон и других (Sorimachi et al., 1997; Goll et al., 2003); изменение их активности описано при некоторых наследственных и эпигенетических нарушениях, дегенеративных заболеваниях (Tidball, Spencer, 2000; Suzuki et al., 2004). К настоящему моменту калытаин-кальпастатиновая система достаточно хорошо изучена у млекопитающих, хотя и в этой области остается ряд нерешенных проблем (Бондарева и др., 2006; Goll et al., 2003). Сведения же о кальпаинах рыб, а также беспозвоночных животных сравнительно фрагментарны (Mykles et al., 1998; Ladrat et al., 2000; 2002; Salem et al., 2004; 2005a, Saito et al., 2007) и зачастую ограничиваются идентификацией кодирующих их нуклеотидных последовательностей. Несмотря на ограниченность структурных исследований Са2+-зависимых протеиназ цитозоля и кодирующих их генов у беспозвоночных и рыб, в отдельных исследованиях
Coscinasterias muricata под воздействием данной группы поллютантов (Georgiades et al., 2003). Результаты гистологического анализа показали, что воздействие нефтепродуктов на двустворчатых моллюсков Муа arenaria и Масота calcarea приводит к развитию некроза пищеварительного тракта, увеличению количества слизи в эпителии пищеварительного тракта, повышает степень зараженности моллюсков паразитами (Neff et al., 1987). При действии высоких концентраций нефти происходит закрытие раковины и потеря чувствительности ресничек у двустворчатых моллюсков, что негативно отражается на процессах дыхания и питания (Bayne et al., 1982; Mageau et al., 1987). Известно, что воздействие нефтепродуктов приводит к изменению в структуре половых клеток и эмбрионов: так у Масота balthica показаны патологические изменения в гонадах (Stekoll et al., 1980). У моллюсков, подвергшихся воздействию нефтепродуктов, наблюдаются биохимические изменения, например, в составе липидов (Bakhmet et al., 2009) и углеводов (Leavitt et al., 1990).
1.3.2. Влияние тяжелых металлов на водные организмы
Металлы (в первую очередь тяжелые, то есть имеющие атомный вес больше 50) относятся к одним из наиболее распространенных и опасных загрязняющих веществ.
Металлы можно подразделить на эссеициальные (биогенные) и неэссенциальные. К первой группе относится большая группа металлов, таких как железо, кобальт, медь, хром, марганец, цинк и др. Эссеициальные металлы необходимы для нормального протекания физиологических процессов. Многие из них являются частью металлоферментов и принимают участие в транспорте кислорода, связывании свободных радикалов, входят в состав макромолекул, гормонов, однако при высоком содержании в окружающей среде оказывают токсическое действие на организм, приводя к нарушению ряда биохимических функций (Будников, 1998; Моисеенко, 2009). Другие металлы, такие как ртуть, кадмий, свинец и мышьяк, известны как высокотоксичные и относятся к неэссенциальным элементам (Patriarca et al., 1998). Некоторые исследователи к неэссенциальным элементам относят также алюминий (Gautheier et al., 2000).