Иммуномодулирующее действие внеклеточных дезоксирибонуклеиновых кислот

• Автор: Черепанова, Анна Витальевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 90 с. : 18 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Иммуностимулирующие эффекты нуклеиновых кислот

1.2. Активация врожденного иммунитета олигонуклеотидами
1.3. Паттерн-распознающие рецепторы нуклеиновых кислот
1.3.1. Toll-like рецепторы
1.3.2. RIG-1-like рецепторы
1.3.3. NOD-like рецепторы
1.3.4. Рецепторы двуцепочечной ДНК

1.4. Внеклеточные нуклеиновые кислоты
1.4.1. Циркулирующие НК-содержащие комплексы
1.4.2. Связанные с поверхностью клеток нуклеиновые кислоты
1.4.3. Происхождение и состав циркулирующих нуклеиновых кислот
1.4.4. Внеклеточные ДНК в норме и при патологиях
1.5. Роль эндогенных внеклеточных нуклеиновых кислот в активации ^
иммунной системы человека
Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Реактивы и материалы
2.1.1. Реактивы
2.1.2. Олигонуклеотиды
2.1.3. Клетки и условия их культивирования
2.2. Методы ^
2.2.1. Гель-электрофорез нуклеиновых кислот и белков
2.2.2. Получение двуцепочечных олигонуклеотидов
2.2.3. Получение и очистка 32Р-меченых олигонуклеотидов
2.2.4. Исследование стабильности олигонуклеотидов при инкубации с
культивируемыми клетками
2.2.5. Получение фракций, содержащих внеклеточные ДНК
2.2.6. Выделение ДНК из клеточных фракций и определение ее 45 концентрации

2.2.7. Выделение геномной ДНК и получение фрагментированной геномной ДНК
2.2.8. Анализ содержания бактериального эндотоксина в реагентах, контактирующих с клетками
2.2.9. Стимуляция клеток под действием свободных и трансфицированных НК
2.2.10. Количественный анализ жизнеспособности меток
2.2.11. Иммуноферментное определение концентрации интерлейкинов
2.2.12. Получение меченой родамином ро1у(1:С) (ро1у(1:С)-Ш))
2.2.13. Приготовление слайдов и микроскопия
2.2.14. Выделение РНК из клеток
2.2.15. Реакция обратной транскрипции
2.2.16. Полимеразная цепная реакция
2.2.17. Получение клеточных фракций
2.2.18. Ступенчатое фракционирование белков мембранно-цитозольного экстракта сульфатом аммония
2.2.19. Формирование комплексов ОДН с белками экстрактов клеток с последующей задержкой олигонуклеотид-содержащих комплексов в геле при электрофорезе (ЕМБА)
2.2.20. Определение величин констант диссоциации (Ка) олигонуклеотид-белковых комплексов
2.2.21. Выделение олигонуклеотид-связывающих белков
2.2.22. Масс-спектрометрия
2.2.23. Изготовление конъюгата антител с пероксидазой хрена
2.2.24. Идентификация взаимодействующих с ОДН белков мембранноцитозольного экстракта при помощи Вестерн-блот гибридизации
2.2.25. Статистика
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Клетки для исследования иммуномодулирующего действия ДНК и условия их культивирования
3.1.1. Условия культивирования клеток
3.1.2. Экспрессия ТЫ19 в НиУЕС и ОЕ
3.2. Исследование иммуномодулирущего действия ДНК различного происхождения
3.2.1. Влияние очищенных препаратов ДНК и олигодезоксирибонуклсотидов на продукцию провоспалительных интерлекинов первичными
фибробластами и эндотелиоцитами
3.2.2. Влияние ДНК на активацию клеток под действием ро1у(1:С) или ЛПС
3.2.3. Олигодезоксирибонуклеотиды сиквенс-специфично ингибируют ро!у(1:С)-индуцированный иммунный ответ
3.2.4. Влияние ДНК на транспорт ро1у(1:С) в кле тки
3.2.5. Олигодезоксирибонуклеотиды ингибируют ро1у(1:С)-индуцированную продукцию интерлейкинов после липофекции
3.2.6. Олигодезоксирибонуклеотиды ингибируют ро1у(1:С)-индуцированную экспрессию мРНК генов, активируемых при воспалении
3.3. Поиск клеточных белков - мишеней иммуномодулирующих олигонуклеотидов
3.3.1. Связывание олигодезоксирибонуклеотидов с белковыми факторами живых клеток и клеточных экстрактов
3.3.2. Выделение и идентификация олигонуклеотид-связывающих белков
3.3.3. Ки белок как основная мишень иммуномодулирующих ДНК
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Большинство исследователей определяют концентрацию внеклеточной ДНК в сыворотке и плазме здоровых доноров около 13 нг/мл, тогда как у больных с различными типами рака концентрация ДНК составляет в среднем 180 нг/мл [98]. Увеличение концентрации свободных внДНК в крови онкологических больных привлекает к себе всё большее внимание исследователей, так как внеклеточные НК потенциально могут участвовать в патогенезе онкологических заболеваний, взаимодействуя с рецепторами опухоли, в связи с активной экспрессией TLR опухолевыми клетками [63,64]. Jahr показал, что количество внДНК опухолевого происхождения составляет от 93 % до 3 % от общего количества внДНК больных, которое составляет от 20 нг/мл плазмы до 360 нг/мл, соответственно [120].
Было показано, что более 90 % внДНК здоровых доноров связано с поверность клеток, в то время как концентрация свободной внДНК не превышает 10 нг/мл. У больных раком желудка и молочной железы наблюдается существенное повышение концентрации свободных внДНК, в то время как у больных раком легкого не наблюдается отличий от здоровых доноров. Напротив, у больных раком легкого и раком молочной железы, но не раком желудка, наблюдается существенное снижение уровня скпДНК. Таким образом, при развитии онокологических заболеваний наблюдается не только изменение концентрации цирДНК, но и изменение отношения свободной и связанной с поверхностью клеток ДНК, которое зависит от типа опухоли и ее локализации.
H.H. Вейко с соавторами показали, что ДНК сыворотки крови больных ревматоидным артритом значительно обогащена фрагментами рибосомных повторов, содержащих иммуностимулирующие CpG мотивы. Избирательное накопление CpG-богатых фрагментов повторов многокопийных генов может служить наиболее удобным способом активации иммунной системы при патологических состояниях [131]. Многие авторы утверждают, что в плазме крови присутствуют РНК, характерные для раковых клеток, такие как мРНК тирозиназы, теломеразных повторов, мРНК различных онкоспсцифических генов, и вирусная РНК [132-136]. Достоверными источниками внРНК являются гетерогенные ядерные рибонуклеопротеиновые частицы [137]. В культуре раковых клеток Heia обнаружены антисмысловые РНК [138]. Поскольку большая часть антисмысловых РНК клетки — транскрипты LINE элементов, их количество во внеклеточном пространстве также может быть преобладающим.
Таким образом, существование внНК в настоящее время не вызывает сомнений. Нуклеиновые кислоты высвобождаются во внеклеточное пространство в значительных количествах в результате физиологических процессов, протекающих в организме, однако в норме не вызывают иммунных реакций. Существует ряд эффективных механизмов