Гуманизация антител против возбудителей чумы и бешенства

• Автор: Ягудин, Тимур Анверович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 161 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение

1. Обзор литературы

1.1. Антитела

1.1.1. Гуморальный и клеточный иммунитет.

Антитела как часть гуморального иммунитета

1.1.2. Строение антител. Вариабельные и константные домены

1.1.3. Константные домены. Тяжёлая цепь и классы иммуноглобулинов. Функции различных классов

1.1.4. Вариабельные домены. Гипервариабельные области.

Каркасные области. Предпосылки графтинга

1.1.5. Образование генов функциональных антител. Сигнальные пептиды. Секвенирование
1.1.6. Рекомбинантные фрагменты антител
1.1.6.1. Антителоподобные конструкции
1.1.6.2. Комплексные и биспецифические антитела
1.1.6.3. Антителоподобные структуры
1.2.Применение терапевтических антител в терапии особо опасных инфекционных заболеваний
1.2.1. Механизмы и модели вирус-нейтрализации
1.2.2. Коктейли антител
1.2.3. Терапевтические антитела против чумного микроба
1.3.Бешенство
1.3.1. Эпидемиология бешенства
1.3.2. Роль гликопротеида И в патогенезе бешенства
1.3.3. Профилактика бешенства и антирабические вакцины
1.3.4. Антирабический иммуноглобулин для пассивной иммунизации
и антителотерапия бешенства

1.4. Чума
1.4.1. Эпидемиология чумы
1.4.2. Роль Б1 антигена в патогенезе чумы
1.4.3. Вакцины против чумы
1.4.4. Пассивная иммунизация и терапевтические антитела
против чумы
1.5.Гуманизация антител
1.5.1. Анализ последовательности
1.5.1.1. Антигенсвязывающие области (ОЖ)
1.5.1.2. Канонические аминокислотные остатки
1.5.1.3. Аминокислотные остатки, стабилизирующие антигенсвязывающий сайт
1.5.1.4. Редкие аминокислотные остатки каркасных областей
1.5.1.5. Потенциальные сайты И-гликозилирования
1.5.2. Трёхмерное компьютерное моделирование структуры антитела
1.5.3. Выбор последовательности человеческой каркасной области
1.5.3.1. Невырожденные белковые последовательности
1.5.3.2. Консенсусные последовательности
1.5.3.3. Последовательности гаметной ДНК
1.5.4. Обратные замены
1.5.5. Перекладка/Маскировка
1.5.6. Перенос областей определяющих специфичность
1.5.7. Применение фаговых библиотек для гуманизации
1.6. Системы продукции антител
1.6.1. Высшие эукариоты 5
1.6.2. Прокариоты
1.6.3. Грибы и дрожжи
1.7. Заключение к обзору литературы
2. Материалы и методы
2.1.Материалы

2.2.Выделение суммарной РНК
2.3.Получение кДНК
2.4.Клонирование генов антител с помощью
полимеразной цепной реакции (ПЦР)
2.4.1. Выбор праймеров для клонирования генов антител
2.4.2. ПЦР с использованием Tag DNA Polymerase
2.4.3. ПЦР с использованием PfLi DNA Polymerase
2.5.Кинирование PCR-фрагментов
2.6. Лигирование
2.7.Трансформация клеток E. coli
2.8.Культивирование E. coli
2.9.Выделение плазмидной ДНК
2.10. Определение нуклеотидной последовательности генов
2.11. Трансфомация Р. pastoris
2.12. Прямой ПЦР скрининг клонов Р. pastoris
2.13. Культивирование Р. pastoris
2.14. Иммуноферментный анализ
2.14.1. F1 антиген Y. pestis
2.14.2. Гликопротеид вируса бешенства
2.15. Ферментация Р. pastoris
2.16. Очистка
2.16.1. F1 антиген Y. pestis
2.16.2. Гликопротеид бешенства
2.17. ДСН-ПААГ электрофорез
2.18. Электроблотинг
2.19. Определение констант связывания
2.19.1. Гликопротеид вируса бешенства
2.19.2. F1 антиген Y. pestis

лечение антибиотиками бывает неэффективно, на первый план выходит купирование иммунопатологических реакций организма, которые и являются непосредственной причиной смерти.
1.4.2. Роль И антигена в патогенезе чумы
При попадании чумной палочки в организм млекопитающего, макрофаги и нейтрофилы, как главные элементы первой линии защиты, поглощают бактерию. Внутри нейтрофилов палочка погибает, тогда как внутри неактивированных макрофагов часть бактерий оказывается способной к размножению. Через 1 -4 часа после проникновения внутрь макрофага У. рехНя образует большую аморфную капсулу, которая состоит из высокомолекулярного полимера одиночного полипептида 15.5 кДа (капсульной субъединицы Б1, субъединицы СаП) [74]. Субъединица СаП пилей секретируется на поверхности бактериальной клетки при помощи шаперонного пути [75] и предварительно полимеризована как линейная матрица субъединиц, удерживаемых вместе при помощи интер-субединичного донорного двухстороннего комплементаризационного механизма [76, 77]. Значение этой высоко-иммуногенной капсулы в защите против заболевания хорошо известно [78]. Эта капсула защищает бактерию от переваривания ее макрофагом, который в дальнейшем становится для бактерии более опасным, поскольку получает цитокиновые сигналы к активизации. Защитив себя при помощи капсулы, чумная палочка использует макрофаг как нишу для размножения и средство транспортировки к лимфоузлам, где заканчивается внутриклеточный этап ее размножения [79, 80].
Результаты, полученные за последние 10 лет, позволяют предположить,
что взаимодействие СаП линейных полимеров с человеческими
интерлейкинами-1 (ЫЬ-1) может играть важную роль в патогенезе чумы [81].
Короткие линейные полимеры СаП, вновь экспрессируемые после заражения
млекопитающего, могут тесно прикрепить бактерию к макрофагам через