Использование атомно-силовой микроскопии для определения белков в сверхнизких концентрациях

• Автор: Шумов, Иван Дмитриевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 107 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
1. Введение
2. Обзор литературы
2.1 Аналитические наносистемы в протеомике
2.2 Факторы, влияющие на чувствительность аналитических наносистем
2.3 Способы функционализации поверхности АСМ-чипов для детекции белков

2.4 Кинетические параметры фишинга
2.5 Характеристика использованных белковых объектов
2.6 Математические модели вылавливания белков на поверхность чипов
3. Методики исследования
3.1 Использованные реактивы
3.2 ACM Veeco Dimension 3100 и зондовая нанолаборатория NTEGRA
3.3 Получение АСМ-изображений
3.4 Обработка АСМ-изображений
3.5 Методика подготовки АСМ-чипов для химического АСМ-фишинга
3.6 Необратимый химический фишинг модельных белков на АСМ-чипы при
концентрациях от 10"9 М до 10'15 М
3.7 Необратимый химический фишинг модельного белка ПХ на АСМ-чипы при
концентрации 10'17 М
3.8 Теоретическое моделирование процесса химического АСМ-фишинга
4. Результаты и обсуждение
4.1. Результаты экспериментов но необратимому АСМ-фишингу и их обсуждение
4.2. Результаты моделирования процесса химического фишинга и обсуждение

4.3. Анализ возможностей повышения чувствительности метода АСМ-фишинга

4.4. Сравнение эффективности химического и биоспецифического фишинга
4.5. Теоретическая оценка возможности сопряжения метода химического АСМ-фишинга с масс-спектрометрией и теоретического предела обнаружения белков АСМ/МС методом

5. Заключение
6. Выводы
7. Финансирование работ
8. Использованные сокращения
9. Литература
10. Благодарности

1. Введение
Актуальность исследования. Согласно оценкам, в плазме крови человека может содержаться порядка 5 млн [Snyder, 2011] типов белков, основной вклад в которые вносят низкокопийные белки с концентрацией ниже 10'15 М. Эти белки могут являться потенциальными маркерами различных патологических состояний человека, в том числе социально значимых заболеваний, таких, как ВИЧ и гепатит С [Archakov et al., 2009], онкологические заболевания [Dexlin-Melby et al., 2011; Rissin et al., 2010]. Некоторые из этих белков уже используются как онкомаркеры для диагностики. На ранних стадиях развития этих заболеваний белки-маркеры присутствуют в крови в концентрациях ниже 10'12 М. В [Rissin et al., 2010] приведены оценки, согласно которым для диагностики онкологических [Dexlin-Melby et al., 2011] и ранних стадий вирусных заболеваний (ВИЧ и гепатит С [Archakov et al., 2009]) концентрационный предел обнаружения (DZ.) диагностических методов также должен быть ниже 10‘15М. Стандартные диагностикумы, базирующиеся на методе иммуноферментного анализа (ИФА), не позволяют регистрировать белки при концентрации ниже 10'13М [Archakov et al.,
2009]. Очевидно, что такой чувствительности недостаточно для обнаружения низкокопийных белков-маркеров, концентрация которых в крови ниже 10‘12 М.
В последнее время были разработаны молекулярные детекторы, обладающие
высокой чувствительностью и позволяющие исследовать свойства единичных
молекул белков. Такая высокая чувствительность молекулярных детекторов
достигается за счет малого размера чувствительного элемента, сопоставимого с
размером белковых молекул. Среди этих детекторов можно выделить
электрические детекторы на основе нанопроволок (НП-детекторы) [Ivanov et al.,
2012; Vu et al., 2012; Tian et al., 2011; Stern et al., 2007; Zheng et al., 2005] и
наномеханические на основе атомно-силового микроскопа (АСМ-детекторы)
[Ivanov et al., 2013; Archakov et al., 2009; Ramanaviciene et al., 2006; Huff et al.,
2004]. В НП-детекторах в качестве чувствительного элемента выступает
нанопроволока из полупроводникового материала, ширина которой составляет
100 нм. Белковые молекулы, адсорбирующиеся в процессе анализа на поверхность
НП, через которую протекает электрический ток, модулируют проводимость
нанопроволоки. Регистрация белковых молекул происходит путем измерения

В этом уравнении авторами [Gaster et al., 2010] выполнен перевод поверхностной концентрации белка в объемную в виде:
С = ^ (1.11)

Аналогичный подход для перевода поверхностной концентрации в объемнуюранее был использован в работе [Archakov et al., 2009] для оценки чувствительности нанотехнологических методов на базе оптического биосенсора и ACM.
Известно, что характер движения раствора аналита относительно поверхности чипа существенным образом влияет на полноту и скорость процесса вылавливания белка на эту поверхность [Левич, 1959]. Поэтому очень важно учитывать характер движения раствора аналита при составлении математических моделей вылавливания. Так, в работе [Vijayendran et al., 1999] для описания подобного процесса использовалась диффузионно-кинетическая модель. Эта модель предполагает, что скорость вылавливания белка на поверхность чипа определяется скоростями двух процессов: диффузии молекул белка к поверхности (1.12; 1.13) и образования связи между белком и активным центром поверхности (1.14):
^ = Z)VJC (1.12),

D = kmC (r~Cs)~ к„ЛСХ О'13)’
^- = kmC(r-Cs)-katCs, О-14),
где С - концентрация белка в объеме анализируемого раствора; Cs —
поверхностная концентрация выловленных молекул белка; D - коэффициент
диффузии белка в растворе; п - нормаль к поверхности чипа; коп— константа
скорости образования «комплекса» белка с активным центром поверхности
чипа, а к0ff константа скорости диссоциации этого «комплекса»; г -
поверхностная концентрация активных центров чипа. Для случая необратимого
связывания белка koJf = 0. После задания соответствующих начальных и
граничных условий решение приведенной выше системы уравнений позволяет
получить зависимость концентрации белка на поверхности чипа от времени
вылавливания. Авторы [Vijayendran et al., 1999] отмечают, что данная модель
может быть применена лишь в отсутствие течения жидкости в статических