Малатдегидрогеназная ферментная система бактерий Rhodobacter sphaeroides: очистка, физико-химические свойства, метаболитная и экспрессионная регуляция

• Автор: Шихалиева, Ксения Джамильевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 146 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Общая характеристика фототрофных пурпурных бактерий
1.1.1 Разнообразие типов метаболизма у пурпурных несерных бактерий
1.1.2 Морфологические и физиологические особенности бактерий 12 КкосІоЬасІег sphaeroid.es
1.1.3. Распространение и практическая значимость исследуемых 16 бактерий
1.1.4. Метаболизм ацетата у данных фототрофных микроорганизмов
1.1.5. Адаптивные изменения ферментных систем
1.2. Особенности функционирования фермента малатдегидрогеназы у
организмов различных таксономических групп.
1.2.1. Методы выделения препаратов МДГ
1.2.2. Общая характеристика каталитического действия
1.2.3. Кинетические параметры
1.2.4. Влияние концентрации ионов водорода
1.2.5. Температурный оптимум 3
1.2.6. Изоформы и изоферменты МДГ
1.3. Структура гена МДГ у различных организмов.
1.4. Молекулярная структура малтдегидрогеназы
1.4.1. Различные уровни организации молекулы МДГ
1.4.2. Строение и механизм действия активного центра МДГ
1.4.3. Факторы, обеспечивающие стабильность и олигомерное 56 состояние молекулы МДГ
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Цель и задачи исследования
2.2. Объекты и методы исследования
2.2.1. Объекты исследования

2.2.2. Методы исследования
2.2.2.1. Состав питательных сред для культивирования
микроорганизмов
2.22.2. Определение активности ферментов
2.2.2.3. Определение количества белка
2.2.2.4. Выделение и очистка МДГ
2.2.2.5. Электрофоретические исследования
2.2.2.5.1. Аналитический электрофорез
22.2.5.2. Определение гомогенности ферментных препаратов
22.2.5.3. Специфическое проявление малатдегидрогеназы
2.2.2.5.4. Определение молекулярной массы субъединиц МДГ
2.22.6. Определение молекулярной массы нативного фермента
22.2.7. Исследование кинетических характеристик и регуляции активности ферментов
2.22.8. Ингибиторный анализ
2.22.9. Определение генетической детерминации множественных
молекулярных форм малатдегидрогеназы
2.2.2.9.1. Выделение геномной ДНК
2.2.2.9.2. Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот в
агарозном геле
2.2.2.9.З. Процесс обратной транскрипции мРНК
2.2.2.9.4. Подбор праймеров
22.2.9.5. Проведение полимеразной цепной реакции
2.22.9.6. Проведение ПЦР в реальном времени
22.2.9.7. Определение уровня экспрессии исследованных генов
2.2.2.10. «Сшивание» белковых молекул бифункциональным реагентом
2.2.3. Статистическая обработка экспериментальных данных
2.3. Полученные результаты и их обсуждение
2.3.1. Влияние различных условий культивирования на активность МДГ
и некоторых ферментов ЦТК и цитрамалатного цикла у исследуемых

микроорганизмов.
2.3.2. Активность и изоферментный состав малатдегидрогеназы из
исследуемых бактерий
2.3.3. Получение гомогенных препаратов МДГ из бактерий
ШюсїоЬасіег sphaeroid.es
2.3.3.1. Очистка малатдегидрогеназы
2.3.3.2. Определение гомогенности ферментных препаратов
2.3.4. Физико-химические свойства МДГ
2.3.4.1. Определение молекулярной массы нативной МДГ из
ЮюсІоЬасіег ір/іаегоісіех
2.3.4.2. Определение субъединичного строения МДГ
2.3.5. Кинетические и регуляторные характеристики МДГ
2.3.5.1. Определение константы Михаэлиса
2.3.5.2. Влияние концентрации ионов водорода
2.3.5.3. Температурный оптимум
2.3;6. Функциональная роль изоформ МДГ у Я. хрИаегоісІез
2.3.6.1. Зависимость четвертичной структуры МДГ от условий
культивирования исследуемых бактерий
2.3.6.2. Влияние итаконата и фторацетата на соотношение димерной и
тетрамерной форм МДГ из бактерий К. кр/іаегоісіеі;
2.3.7. Определение генетической детерминации множественных
молекулярных форм МДГ
2.3.7.1. Идентификация гена тсік
2.3.8. Изучение уровня экспрессии гена тсік у бактерий в различных
условиях культивирования
2.3.9. Физико-химические факторы, вызывающие процесс
ассоциации-диссоциации фермента малатдегидрогеназы
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

Различия между кинетическими параметрами реакций окисления малата и восстановления оксалоацетата могут быть использованы клеткой как способ избирательного осуществления того или иного биохимического превращения. Как правило, сродство МДГ к коферментам выше, чем к субстратам, т.к. с ферментом сначала связывается кофермент, и лишь потом субстрат. Однако для митохондриальной МДГ из неоплодотворенных яиц морского ежа показано, что значение Км по оксалоацетату составило 19 мкМ, а значение Км по НАДН 30 мкМ, т.е. сродство фермента к оксалоацетату оказалось выше, чем к коферменту [153 ].
Показано, что высокие концентрации субстратов и НАДН ингибируют работу фермента [122, 135, 144, 210]. Это связано с образованием
неэффективных фермент-субстратных комплексов (например, МДГ-малат-ИАОН) или комплексов, обладающих длительным периодом распада (МДГ-ІЧАОН-оксалоацетат.
Однако, в ряде работ продемонстрировано, что фермент из некоторых источников не ингибируется избытком оксалоацетата и НАДН, а высокие концентрации малата могут даже активировать фермент [91, 126 , 128 , 139, 162].
1.2.4. Влияние концентрации ионов водорода.
Изменение pH раствора - один из наиболее важных факторов, определяющих состояние белковой молекулы. Зависимость активности фермента от pH определяется еде дующими факторами: (1) денатурацией фермента при очень высоких или очень низких pH; (2) изменением величины заряда молекул субстрата или фермента. pH оказывает влияние на состояние ионизации функциональных групп фермента, т. е., на распределение заряда внутри молекулы. Т. к. распределением заряда определяется способность