Изучение механизмов противовоспалительной активности бифидобактерий и создание методами генетической инженерии штаммов бифидобактерий с усиленными противовоспалительными свойствами

• Автор: Хохлова, Екатерина Викторовна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 107 с. : 24 ил.

Содержание
Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Введение

1.2 Бифидобактерии как облигатные представители кишечного микробиоценоза

1.3 Взаимодействие микрофлоры с системой

врожденного иммунитета в кишечнике

1.4 Вклад бактерий нормальной микрофлоры в поддержание

гомеостаза в кишечнике

1.5 Механизмы подавления воспалительного ответа на антигены нормальной микрофлоры в кишечнике
1.6 Микроорганизмы как векторы для направленной доставки лекарственных препаратов в кишечник 33 Глава 2. Материалы и методы
2.1 Бактериальные культуры
2.2 Фракционирование бактериальных культур
2.3 Культуры эукариотических клеток
2.4 Изучение связывания ЛПС с клетками и проточная цитометрия
2.5 Выделение ДНК из бактерий
2.6 ПЦР. ПЦР в реальном времени
2.7 Методы молекулярного клонирования. Синтез гена
2.8 Анализ экспрессии репортерного гена люциферазы
2.9 Выделение РНК и обратная транскрипция
2.10 Синтез олигонуклеотидов
2.11 Трансформация бифидобактерий и кишечной палочки
2.12 Иммуноферментный анализ
2.13 Электрофорез в агарозном и полиакриламидом геле
2.14 Секвенирование плазмидных ДНК
2.15 Выделение и очистка белков. Высаливание, диализ. Ионообменная хроматография. Масс-спектрометрический анализ
2.16 Иммуноблоттинг
2.17 Методы биоинформатики и статистической обработки данных 55 Глава 3. Собственные результаты
3.1 Изучение противовоспалительной активности комменсальных
штаммов бифидобактерий
3.2 Изучение химических свойств активных компонентов культуральных супернатантов бифидобактерий
3.3 Изучение механизма противовоспалительной активности бифидобактерий
3.4 Изучение влияния бифидобактерий на экспрессию в клетках НТ-29 генов, продукты которых вовлечены в процессы воспаления и апоптоза
3.5 Изучение секретируемых белков В. breve UCC2003
3.6 Экспрессия гена ИЛ-10 человека в клетках бифидобактерий с помощью серии челночных клонирующих векторов
3.7 Клонирование и экспрессия гена D2E7mut
3.8 Изучение биологической активности рекомбинантных белков, секретируемых штаммами бифидобактерий
Глава 4. Обсуждение полученных результатов
Выводы
Список литературы

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность
Одной из первых групп мутуалистических бактерий, заселяющих стерильный кишечник доношенных новорожденных после естественных родов, являются бифидобактерии. Род Bifidobacterium относится к классу Actinobacteria и включает в себя грамположительные неспорообразующие облигатно-анаэробные палочки с высоким содержанием пар гуанин-цитозин в геномной ДНК [323]. Благотворное влияние бифидобактерий на физиологию желудочно-кишечного тракта и всего организма в целом связывают с их способностью к конкурентному подавлению патогенных и условно-патогенных бактерий, способностью к продукции витаминов и других биологически активных соединений, а таюке противовоспалительной, антиканцерогенной и иммуномодулирующей активностью [94, 160, 266, 292]. Позитивные свойства
бифидобактерий в сочетании с полным отсутствием факторов патогенности объясняют высокий интерес исследователей к данной группе микроорганизмов.
С позиции практической медицины одним из наиболее важных свойств бифидобактерий является их противовоспалительная активность. Известно, что у больных с тяжелыми воспалительными заболеваниями кишечника (болезнью Крона, неспецифическим язвенным колитом) наблюдается резкое снижение титра бифидобактерий и ряда других комменсалов (бактероидов, клостридий групп 1Ха и IV, Faecalibacterium praustnitzii) в фекальной микрофлоре [84, 222, 291]. Одновременно с этим была показана способность ряда пробиотических формул, содержащих бифидобактерии, вызывать и поддерживать стойкую ремиссию у пациентов с неспецифическим язвенным колитом, синдромом раздраженного кишечника и резервуарным илеитом [113, 209]. Исследования с использованием животных и клеточных моделей также выявили способность бактерийных препаратов на основе бифидобактерий подавлять развитие воспаления в слизистой оболочке толстого кишечника, снижать интенсивность симптомов колита, подавлять секрецию провоспалительных цитокинов и стимулировать продукцию противовоспалительных факторов иммунокомпетентными клетками [191, 206]. Однако вопрос о механизме этой
противовоспалительной активности и роли секретируемых метаболитов и компонентов клеток бифидобактерий в ее проявлении до сих пор остается открытым.
Выяснение молекулярных механизмов противовоспалительного эффекта бифидобактерий расширит наши представления о путях взаимодействия бактерий-комменсалов с организмом хозяина, позволит глубже понять роль микрофлоры в регуляции воспалительных процессов в кишечнике, и приведет к созданию новых лекарственных

которого помещается ген целевого белка, и гена РНК полимеразы бактериофага Т7 под контролем индуцибельного промотора [294, 334], причем максимальную эффективность эта система показывает при использовании промотора, регулируемого антимикробным пептидом — низином — его стимуляция позволяет добиваться тысячекратного значения индукции [203]. Обеспечило успех и то, что на более или менее значимом уровне лактококки секретируют всего несколько белков, и кроме того, не продуцируют ни одной экстраклеточной протеазы [231]. С использованием низиновой системы экспрессии был сконструирован штамм Lactococcus lactis, продуцирующий ИЛ-10 человека, проявляющий биологическую активность in vitro и in vivo [295]. Данный- штамм был предложен в качестве альтернативного ЛП для лечения ВЗК в противовес классической противовоспалительной и иммуносупрессивной терапии кортикостероидами, препаратами аминосалицилатов, азатиоприном, применение которых неизменно связано с развитием серьезных побочных эффектов. ИЛ-10 при парентеральном введении, несмотря на хорошую переносимость, эффективен только для пациентов с низкой или средней активностью воспалительных процессов, а в остальных случаях наблюдается лишь улучшение клинической картины, не приводящее к наступлению ремиссии [86, 287]. Это можно объяснить особенностями фармакокинетики и биораспределения цитокина, выражающимися в быстром исчезновении ИЛ-10 из кровотока [254]. По итогам первого этапа клинических испытаний, направленная доставка ИЛ-10 в кишечник пациентов с БК с помощью генетически модифицированных лактококков не имеет побочных эффектов и приводит к значительному снижению активности заболевания [54]. В настоящее время рекомбинантные штаммы Lactococcus lactis проходят второй-этап клинических испытаний под торговой маркой Актобиотики (Actobiotics) [297]. Применение генетически модифицированных организмов несет в себе риск горизонтального переноса генов, поэтому препараты класса GRAS (Generally Recognized As Safe) не несут маркеров антибиотикорезистентности и содержат минимальное количество чужеродной ДНК. Более того, рекомбинантные лактококки являются ауксоторфными микроорганизмами за счет замены гена тимидилат синтазы на экспрессионную кассету с геном ИЛ-10. Причем отсутствие тимидина в среде не просто ингибирует размножение бактерий, но и вызывает клеточную гибель [296], что позволяет предотвратить распространение микроорганизмов в окружающей среде. Еще одним потенциально терапевтическим штаммом Lactococcus lactis является штамм, продуцирующий одноцепочечные камелидные миниантитела к ФНО-а [320]. Этот новый класс молекул, известный как Nanobody, приобретает большую популярность, поскольку обладает меньшей, по сравнению с обычными антителами, молекулярной массой (благодаря отсутствию легких цепей), большей растворимостью и