Геномика и протеомика литических бактериофагов Pseudomonas aeruginosa

• Автор: Мирошников, Константин Анатольевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 169 с. : 65 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Общие сведения о морфологии, таксономии, экологи и эволюции
фагов
1.1.1. Жизненный цикл бактериофагов
1.1.2. Классификация бактериофагов на основе их морфологии
1.1.3. Гипотезы о происхождении бактериофагов
1.1.4. Роль бактериофагов в формировании биосферы
1.1.5. Структура микробных сообществ. «Убить победителя»
1.1.6. Влияние фагов на жизнеспособность бактерий
1.2. Разнообразие бактериофагов и современные методы их изучения и
систематизации
1.2.1. Культуральные методы и их ограничения
1.2.2. Изучение разнообразия бактериофагов на основе единого локуса
1.2.3. Изучение разнообразия бактериофагов метагеномными методами
1.3. Применение бактериофагов для контроля и лечения инфекций,
вызванных патогенными бактериями
1.4. Пептидогликанлизирующие ферменты (ПЛФ) бактериофагов
1.5. Pseudomonas aeruginosa - микроорганизм-хозяин исследуемых
бактериофагов
1.5.1. Факторы вирулентности P. aeruginosa
1.6. Бактериофаги P.aeruginosa
1.6.1. Фаги бактерий рода Pseudomonas sp. Общие сведения
1.6.2. Фаги P.aeruginosa семейства Myoviridae
1.6.3. Фаги Pseudomonas семейства Siphoviridae
1.6.4. Фаги Pseudomonas семейства Podoviridae
1.7. Заключение
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Использованные в работе материалы
2.1.1. Реактивы и растворы
2.1.2. Штаммы бактерий
2.1.3. Плазмиды
2.1.4. Культуральные среды
2.1.5. Олигонуклеотиды

Основные методы
Выделение бактериофагов
Выделение бактериофагов в препаративных масштабах
Очистка бактериофагов
Осаждение полиэтиленгликолем/ультрацентрифугирование в градиенте концентрации хлористого цезия
Гель-фильтрация на микропористом стекле
Анионообменная хроматография
Выделение и рестрикционный анализ ДНК
Определение последовательности геномов фагов
Конструирование генной библиотеки для вЬоип-секвенирования
Стратегия Сэнгеровского секвенирования
Определение концов геномов
Компьютерный анализ последовательности геномов фагов
Экспериментальное определение промоторов
Создание экспрессионной библиотеки генома
Анализ протеомовфагов
Белковые профили фагов и зимографический анализ
Масс-спектрометрическое определение белковвириона
Электронная микроскопия и реконструкция криоэлектронно-микроскопических изображений
Электронная микроскопия негативного контрастирования
Иммуноэлектронная микроскопия
Криоэлектронная микроскопия
Реконструкция изображений
Молекулярное клонирование и экспрессия
Амплификация фрагментов ДНК
Встраивание фрагментов ДНК в векторную плазмиду
Экспрессия генов и анализ растворимости рекомбинантного белка
Выделение и очистка рекомбинантных белков
Преципитация сульфатом аммония
№-хелатная аффинная хроматография
Анионообменная хроматография
Г ель-фильтрация
Характеризация белков физико-химическими методами

2.10.1. Определение олигомерности белка гель-фильтрацией
2.10.2. Спектрометрия кругового дихроизма
2.10.3. Иммунизация
2.10.4. Иммуноблотинг
2.10.5. Детекция активности ПЛФ
2.10.6. Количественное определение активности ПЛФ
2.11. Кристаллизация белков и рентгеновская кристаллография
2.11.1. Синтез и очистка селенометионинового производного
2.11.2. Кристаллизация белка и сбор рентгенографических данных
2.11.3. Решение структуры белка и построение модели
2.11.4. Молекулярное моделирование и докинг
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Хроматографическая очистка бактериофагов
3.1.1. Хроматография на широкопористом стекле
3.1.2. Ионообменная хроматография
3.1.3. Контроль чистоты и целостности частиц
3.1.4. Контроль пирогенности препаратов
3.2. cpKZ-подобные бактериофаги семейства Myoviridae
3.2.1. Общая характеристика и оценка биоразнообразия cpKZ-подобных
бактериофагов
3.2.2. Морфологическая характеристика cpKZ - подобных бактериофагов
3.2.3. Общая характеристика геномов cpKZ - подобных бактериофагов
3.2.4. Протеомика cpKZ - подобных бактериофагов
3.2.4.1. Белки вириона, ассоциированные с РНК-полимеразой
3 3.2.4.2. Протеолитический процессинг и предполагаемый состав «внутреннего
тела» головки cpKZ-подобных фагов
3.2.5. Исследования индивидуальных белков cpKZ - подобных бактериофагов
3.2.5.1. ELgp 146-уникальный шаперонин бактериофага
3.2.5.1.1. Открытая конформация (АТР)
3.2.5.1.2. Закрытая (ADP) конформация
3.2.5.1.3. Апо-конформация (без нуклеотидов)
3.2.5.2. cpKZgpl44 - Пептидогликанлизирующая трансгликозилаза
3.2.5.2.1. Структура TV-концевого домена cpKZgpl44
3.2.5.2.2. Структура каталитического домена
3.2.5.2.3. Механизм реакции, катализируемой cpKZgpl44. Предполагаемая модель

3. Препараты фага должны содержать инфекционные для бактерий частицы фага, поэтому необходимо соблюдать особые условия хранения препарата.
4. Препараты фага должны отвечать всем требованиям безопасности и не иметь бактериальных или иных токсических загрязнений. Большинство описанных случаев применения фаговой терапии основано на пероральном приеме фаговых препаратов. Этот способ нельзя считать максимально эффективным, к тому же он несет в себе риск множества побочных эффектов, обусловленных загрязнением препарата примесями, включая эндотоксины и экзотоксины.
Для оценки возможных осложнений при фаговой терапии полезно знание полного генома бактериофага, поскольку некоторые фаги могут нести гены факторов вирулентности или токсинов (Chibani-Chennoufi et al., 2004b).
5. Желательно знать рецептор фага. В популяции из 106 - 108 бактерий существует вероятность спонтанных мутаций с потерей или изменением рецептора, что снижает эффективность фаговой терапии.
6. Эффективность фаговой терапии должна быть предварительно проверена на соответствующей животной модели. Характер поведения каждого фага in vivo индивидуален. В настоящий момент совокупность данных о фармакокинетике действия фагов по-прежнему очень мала. Проведенные исследования показали, что титр фагов, поступивших в кровь мышей после перорального приема, падает на семь порядков в течение двух часов. Фаги эффективно выводятся из кровотока ретикулоэндотелиальной системой печени и селезенки. Эта проблема частично решается поиском «долгоциркулирующих» мутантов фагов, способных дольше сохраняться в кровотоке и, следовательно, быть более эффективными терапевтически (Biswas et al., 2002).
Описание фармакокинетики чрезвычайно затрудняется самореплицирующейся природой фага. Параметры роста конкретного фага in vitro нельзя напрямую переносить в ситуацию in vivo, поскольку значения этих параметров могут заметно различаться (Рауле and Jansen, 2003). Список критических параметров включает в себя скорость адсорбции фага, латентный период, начальную дозу фага, уровень вязкости, промежутки времени, ассоциированные с каждым из этапов развития фага, а также скорость выведения фаговых частиц из организма ретикулоэндотелиальной системой.
7. Необходима проверка иммуногенности фага. С одной стороны, иммуногенность является важным параметром фармакокинетики фаговой терапии, а с другой — ею могут быть обусловлены серьезнейшие побочные эффекты, вплоть до анафилактического шока. Большинство фагов при первичном применении являются «нео-антигенами» для организма животных и человека, т.е. заранее имеющихся против них антител в организме