Выделение и характеристика поверхностных белков галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z

• Автор: Щукин, Владимир Николаевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 116 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Структурно-функциональные особенности метанотрофов

1.1. Пути первичного метаболизма метанотрофов. Роль меди в окислении метана

1.2. Системы поглощения меди у метанотрофов. Метанобактин

Глаьа 2. Структурно-функциональные особенности метанотрофов соленых и щелочных водоемов

2.1. Гало(алкало)фильные метанотрофы

2.2. Основные стратегии адаптации метанотрофов к высоким значениям

солености и pH

Г лава 3. Общая характеристика бактериальных Б-слоев

3.1. Выделение и химический состав Б-слоев
3.2. Функции Б-слоев
3.3. Способность Б-слоев к самосборке и практическое применение
3.4. Цитохром с пероксидазы бактерий
ЗЛ Поверхностные белки метанотрофов
3.6. Б-слои метанотрофов
Глава 4. Материалы и методы исследования
4.1. Объекты исследования и культивирование бактерий
4.2. Детекция и выделение основных поверхностных белков Мт. акаНркПит 20Ъ
4.3. Трипсинолиз белка в геле и экстракция пептидов
4.4. Экстрагирование поверхностных белков
4.5. Получение поликлональных антител
4.6. Разделение белков Б-слоя Мт. акаНркИит 20Z в градиенте сахарозы
4.7. Электрофорез в ДСН-ПААГ
4.8. Иммуноблоттинг
4.У. Выделение геномной ДНК
4.10. Выделение плазмидной ДНК
4.11. Выделение РНК
4.12. ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)
4.13. Векторетная ПЦР
4.14. Получение компетентных клеток и их трансформация
4.15. Клонирование и экспрессия гена когВ’
4.16. Очистка фрагментов ДНК
4.17. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и лигирование фрагментов ДНК
4.18. Выделение рекомбинантных белков с помощью металлхелатной хроматографии
4.19. Определение концентрации белка
4.20. Получение инсерционных мутантов по генам ‘согА ' и ‘согВ ’
4.21. Микроскопические исследования
4.22. Определение включения І4СНі суспензиями клеток
4.23. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей
4.24. Определение активности ферментов
4.25. Определение пероксидазной активности в геле
4.26. Определиние состава жирных кислот
4.27. Определение содержания сахарозы и эктоина в клетках Мт. аІсаІірИіІит 20Ъ
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 5. Особенности ультраструктуры клеток галоалкалофильных метанотрофов
5.1. Детекция и выделение основных поверхностных белков Мт. аісаііркіїит 20Z
5.2.2. Идентификация 27-кДа белка
5.2.3. Идентификация 80-кДа белка
5.3. Изучение функции белка ‘СогВ’
5.4. Изучение экспрессии генов 'согА ’ и 'согВ'
5.5. 7'опология белка‘СогА’
5.6. Топология белка ‘СогВ’
5.7. Получение и анализ инсерционных мутантов по генам ‘согА ’ и ‘согВ ’
5.7.1. Фенотипическая характеристика ‘СогА’- мутанта Мт. аісаіірініит
5.7.2. Фенотипическая характеристика ‘СогВ’- мутанта Мт. аісаіірініит
5.7.3. Уровни осмопротекторов и жирнокислотный состав мутантов
5.8. Идентификация 59-кДа белка
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ААП - 4 - аминоантипирин
АБТС - 2,2’ - азино-бис(З-этилбензтиазолин-б-сульфонат) аммония
АДФ - аденозиндифосфат
АТФ- аденозинтрифосфат
АМО - аммониймонооксигеназа
АФК - активные формы кислорода
дНТФ - дезоксинуклеотидтрифосфаты
Ni2+-NTA - нитроацетат агароза
БСА - бычий сывороточный альбумин
ВКМ - Всероссийская Коллекция Микроорганизмов
ВССР - бактериальная цитохром с пероксидаза
ВЦМ - внутрицитоплазматические мембраны
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
ГГХ - гуанидин гидрохлорид
ГФС - гексулозофосфатсинтаза
ДАБ - 3,3’ - диамино-бензидин
ДСН - додецилсульфат натрия
ДХФИФ - 2,6 - дихлорфенолиндофенол
ИПТГ - изопропил - 1 - тио-/?-D-галактопиранозид
КоА - кофермент А
КС - клеточная стенка
м.м. - молекулярная масса
Мб - метанобактин
МДГ - метанолдегидрогеназа
мММО - мембрансвязанная метанмонооксигеназа
рММО - растворимая метанмонооксигеназа
ММО - метанмонооксигеназа
НАД(Ф)+ - никотинамидаденнидинуклеотид(фосфат), окисленный НАД(Ф)Нг - никотинамидадениндинуклеотид(фосфат), восстановленный н.о. - нуклеотидные основания His - гистидин
ОРС - открытая рамка считывания
ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция, сопряженная с обратной транскрипцией п.н. - пары нуклеотидов
обладает большей связывающей способностью, чем волокнистая структура (Sara, Sleytr, 2000).
Показано, что S-слои грамотрицательных бактерий Aeromonas salmonicida, Cammlobacter fetus и Caulobacter crescentus выполняют также функцию защиты от внутриклеточных паразитов, таких как Bdellovibrio bacteriovorus (Koval, 1997). Кроме того, описана способность S-слоев Methylococcus capsulatus защищать клетки от инфицирования бактериофагами (Гальченко, 2001).
S-слой Lactobacillus brevis обладает свойством связываться с коллагеном и фибринонектином, обеспечивая таким образом адгезию бактериальных клеток, покрытых S-слоями на эпителиальных клетках человека (Hynonen et al., 2002). S-слой Lactobacillus acidophilus, способен адсорбироваться на эпителии кишечника кур (Lorea et al., 2002). Коллаген и фибринонектин представляют собой основу межклеточного матрикса высших животных и общую мишень патогенных бактерий. Так, патогенная для рыб бактерия Aeromonas salmonicida внедряется в межклеточный матрикс с помощью S-слоя. Таким образом, S-слой является важным фактором патогенности (Schneitz et al., 1992). Это свойство характеризует и S-слои Campilobacter fetus, вызывающего болезнь кур (Dworkin, Blaser, 1997).
Интересна функция S-слоя цианобактерии Synechococcus (штамм GL24). Эта бактерия обитает в достаточно сильно минерализованном озере (штат Нью-Йорк), и поры S-слоя этой бактерии служат матрицей для кристаллизации гипса или кальцита. Минерализованный слой постоянно удаляется с поверхности бактерий, защищая таким способом клетку. Возможно, это явление играет роль при образовании тонкодисперсных минералов в природе (Sara et al., 1992).
Существенная функция S-слоев - это обеспечение клеточной адгезии (Smith et al., 2002). Показано, что "адгезивность" S-слоев к твердым поверхностям зависит от их химического состава и условий окружающей среды. По сравнению с мутантами, дефицитными по S-слою, термофильные бациллы, имеющие данные слои, обладают намного большей способностью адсорбироваться на положительно заряженных или гидрофобных поверхностях (Sleytr, Sara, 1997). Для многих архей и эубактерий показано, что S-слои самостоятельно или в комбинации с другими поверхностными компонентами клетки, например, липополисахаридами, могут усиливать аутоагглютинацию (Baumeister, Lembcke, 1992).
В последние годы убедительно показано, что S-слои, играющие важную многофункциональную роль в жизнедеятельности микробной клетки, представляют собой более общее явление, чем это предполагалось ранее. Хотя получены обширные данные о