Регуляция NMDA-рецепторами функций Т-лимфоцитов человека

• Автор: Зайнуллина, Лиана Фанзилевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 152 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Глутамат и рецепторы глутамата в центральной нервной

системе

1.1.1 Классификация рецепторов глутамата

1.1.2 Ионотропные рецепторы глутамата ПУША-подтипа:

структура, функции, динамика в онтогенезе

1.1.3 Зависимость фармакологических и биохимических свойств

ХУГОА-рсцепторов от субъединичного состава
1.2 Рецепторы глутамата в периферических системах, в том
числе, в иммунной системе
1.3 Роль глутамата и его рецепторов в функционировании
клеток иммунной системы
1.3.1 Влияние глутамата и рецепторов глутамата на
выживаемость и пролиферацию Т-лимфоцитов
1.3.2 Участие глутамата в механизмах кальциевой сигнализации
в Т-лимфоцитах
1.3.3 Роль глутамата и рецепторов глутамата в механизме
апоптоза Т-лимфоцитов
1.3.4 Влияние глутамата на механизмы адгезии и хемотаксиса
Т-лимфоцитов
1.3.5 Участие глутамата в регуляции секреции цитокинов
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Материалы исследования
2.1.1 Общая характеристика доноров
2.1.2 Перечень использованных материалов и реактивов
2.2 Методы исследования
2.2.1 Методы исследования функционального состояния
отдельных компонентов иммунной системы
2.2.1.1 Забор крови
2.2.1.2 Выделение лимфоцитов периферической крови
2.2.1.3 Культивирование лимфоцитов периферической крови
2.2.1.4 Оценка жизнеспособности Т-лимфоцитов в условиях
блокады ИМОА-рецепторов
2.2.1.5 Оценка пролиферативной активности и анализ клеточного
цикла лимфоцитов
2.2.1.6 Оценка апоптоза в культуре Т-лимфоцитов

2.2.1.7 Количественное определение уровня цитокинов с
помощью иммуноферментного анализа
2.2.1.8 Измерение концентрации внутриклеточного кальция в Т-
лимфоцитах
2.2.2 Иммуноцитохимическое окрашивание лимфоцитов
2.2.2.1 Иммунофенотипирование лимфоцитов
2.2.2.2 Определение содержания фосфорилированных форм
протеинкиназ
2.2.2.3 Изучение экспрессии субъединиц ИМОА-рецепторов
2.2.2.3.1 Проточная цитофлуориметрия
2.2.2.3.2 Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия
2.2.3 Молекулярно-генетические методы
2.2.3.1 Выделение суммарной РНК
2.2.3.2 Синтез кДНК с помощью РНК-зависимой ДНК-
полимеразы
2.2.3.3 ОТ-ПЦР в режиме реального времени
2.2.3.4 Приготовление тотального клеточного лизата для
иммуноблоттинга
2.2.3.5 Электрофорез белков
2.2.3.6 Электроперенос белков из акриламидных гелей на
мембранные фильтры (блоттинг)
2.23.1 Гибридизация с антителами
2.2.3.8 Детекция белков
2.2.4 Статистическая обработка результатов исследования
Г ЛАВ А 3. ИМИ А-РЕЦЕПТ ОРЫ В Т-ЛИМФОЦИТАХ ЧЕЛОВЕКА
3.1 Идентификация и локализация субъединиц ЫМОА-
рецепторного комплекса в Т-лимфоцитах человека
3.1.1 Экспрессия мРНК генов, кодирующих субъединицы
ИМСА-рецепторов
3.1.2 Внутриклеточная экспрессия субъединиц ИМОА-
рецепторов. Локализация на эндоплазматическом ретикулуме
3.1.3 Представленность субъединиц НМОА-рецепторов на
плазматической мембране Т-лимфоцитов
ГЛАВА 4. ИМБА-РЕЦЕПТОРЫ - КОМПОНЕНТЫ ДЕПО -
ЗАВИСИМОГО ВХОДА Са2+ В Т-ЛИМФОЦИТЫ ЧЕЛОВЕКА
4.1 Изучение влияния блокады НМОА-рецепторов на уровень
Са2+ при использовании тапсигаргиновой модели емкостного входа ионов
ГЛАВА 5. НМЦА-РЕЦЕПТОРЫ В РЕГУЛЯЦИИ КЛЮЧЕВЫХ
ФУНКЦИЙ Т-ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА
5.1 Оценка жизнеспособности культуры Т-лимфоцитов при
блокаде МУГОА-рецепторов

5.2 Анализ клеточного цикла активированных in vitro Т-
лимфоцитов в условиях блокады NMDA-рецепторов
5.3 Оценка пролиферации активированных in vitro Т-
лимфоцитов в условиях блокады NMDA-рецепторов
5.4 Участие NMDA-рецепторов в регуляции апоптоза Т-
лимфоцитов
5.5 Цитокиновый профиль Т-лимфоцитов при блокаде NMDA-
рецепторов
5.6 Пути дифференцировки Т-лимфоцитов в условиях блокады
NMDA-рецепторов
ГЛАВА 6. ПУТИ СИГНАЛЬНОЙ ТРАНСДУКЦИИ ОТ NMDA-
РЕЦЕПТОРОВ В Т-ЛИМФОЦИТАХ
6.1 Активация ключевых протеинкиназ митоген-
активируемого каскада (МАРК) в условиях блокады NMDA-рецепторов
6.2 Эффект блокады NMDA-рецепторов на активацию
протеинкиназы Са2+ / кальмодулин- зависимых сигнальных путей - рСаМКП
6.3 Изменение уровня рРКСО - протеинкиназы ДАГ-
зависимого сигнального пути при блокаде NMDA-рецепторов
6.4 Влиянии блокады NMDA-рецепторов на уровень
pGSK-ЗР - протеинкиназы PB/Akt-зависимого сигнального пути
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

В 2004 году группой проф. Болдырева A.A. было установлено, что в Т-лимфоцитах крыс активация касказы-3 - одного из ключевых ферментов, приводящих к запуску программируемой клеточной гибели - происходит вследствие стимуляции NMDA-рецепторов Ы-метил-О-аспартатом. Вместе с тем авторы показали, что активация каспазы-3 не обнаруживается при инкубации клеток с агонистом метаботропных глутаматных рецепторов III - L-AP4, тем самым доказав вовлеченность именно ионотропных рецепторов глутамата, в частности, NMDA подтипа, в регуляцию апоптоза. Кроме того, стимуляция NMDA-рецепторов в Т-лимфоцитах крыс, согласно авторам, приводит к увеличению содержания внутриклеточного кальция и генерации активных форм кислорода.
1.3.4 Влияние глутамата на механизмы адгезии и хемотаксиса Т-лимфоцитов
Широко известно, что активированные антигеном Т-клетки способны к миграции, мобилизации и проникновению в очаги воспаления посредством адгезии к гликопротеинам (фибронектину, ламинину) экстраклеточного матрикса клеток-мишеней (Lloyd, 1996). Кроме того, белки межклеточной адгезии на мембране Т-клеток необходимы для функционального взаимодействия Т-клеточного рецептора с белками главного комплекса гистосовместимости.
Исследование возможного эффекта глутамата на способность Т-клеток к адгезии к гликопротеинам экстраклеточного матрикса показало, что медиатор в широком диапазоне концентраций (10‘12-10‘6 М) в отсутствии каких-либо дополнительных стимулов запускает интегрин-опосредованную адгезию к ламинину и фибронектину, и этот процесс зависит от АМРА-рецепторов. Подобный эффект установлен и для синтетических агонистов АМРА и каинатных рецепторов; в тоже время, антагонисты АМРА-рецептора уменьшают глутамат-индуцированную адгезию Т-лимфоцитов (Ganor, 2003).