Получение генетически кодируемых FRET-сенсоров каспазы-3 на основе тербий-связывающего пептида и красных флуоресцентных белков DsRed2 и TagRFP

• Автор: Арсланбаева, Ляйсан Равиловна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 124 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Изучение ферментативной активности каспазы-3 с помощью FRET-БИОСЕНСОРОВ

1.2. Проблема фоновой флуоресценции

1.3. Флуоресцентные свойства лантанидов. Сенсибилизация флуоресценции. Лантанид-связывающие пептиды

1.4. Многофотонное возбуждение лантанидов

1.5. Основные тенденции изучения индуктивно-резонансного переноса энергии

1.6. Комплексные соединения лантанидов в качестве доноров во FRET-парах при изучении биологических процессов и проведении биоаналитических
реакций
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Оборудование
2.2. Реактивы
2.3. Методы исследования
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Характеристика экспрессии флуоресцентных белков в условиях in vitro и in vivo
3.2. Получение генетически кодируемых конструкций, кодирующих гибридные белки
3.3. Получение высокоочищенных фракций гибридных белков и определение их АГРЕГЛТНбГО СОСТОЯНИЯ
3.4. Изучение переноса энергии
3.5. Определение активности каспазы-
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АФЦ аллофикоцианин
ДТТ дитиотриэтол
ИПТГ изопропилтиогалактозид
отн. ед. относительная единица
п.н. пар нуклеотидов
ПЦР полимеразная цепная реакция
ПААГ полиакриламидный гель
Трп-СП триптофан в составе тербий-связывающего пептида
УФ ультрафиолет
ХСД хитин-связываюгций домен
ЭДТА этилендиаминтетраацетат
Абоо значение оптической плотности при 600 нм
Ac-DEVD-AMC ацетил-ОЕТ)-7-амино-4-метилкумарин
AFC 7-амино-4-трифлуорометилкумарин
АМСА 7-амино-4-метил-3-кумаринилацетамид
CHAPS 3-[(3-холамидопроиил)диметиламмоний]-1-пропансульфонат
DNA-PKcs каталитческая субъединица ДНК-зависимой протеинкиназы
DsRed2 коммерческое название красного флуоресцентного белка
(Discosoma Red fluorescent protein)
Eu3+ ион европия
FLIM Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (микроскопия
времёни жизни флуоресценции)
FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer (флуоресцентный
резонансный перенос энергии)
HEPES 4-(2-оксиэтил)1-пиперазинэтансульфоновая кислота
HTRF Homogeneous Time-Resolved Fluorescence
(коммерциализованная технология гомогенного анализа с
временным разрешением) константа диссоциации T.R Lûria-Bertani
PARP поли(АДФ-рибозо)полимераза
PBS phosphate buffer saline (фосфатно-солевой буфер)

TagRFP

ТЬ3+-СП(1)
ТЬ3+-СП(2)
ТЬ3+-СП( 1 )-DsRed
DsRcd2-Tb3+-CII( 1 )
Tb3+-Cn(2)-DsRed
Tb3+-Cn-DEVD-DsRed
Tb3+-Cn-DEVD-TagRFP
TEMED
TRACE
TR-FRÈT
коммерческое название красного флуоресцентного белка (Red Fluorescent Protein) ион тербия
тербий-связывающий пептид GDKNADGWTEFEEL
тербий-связывающий пептид YIUTNNDGWYEGDELLA
гибридный белок на основе тербий-связываюгцего пептида(І)
и красного флуоресцентного белка DsRed
гибридный белок на основе красного флуоресцентного белка
DsRed2 и тербий-связывающего пептида(І)
гибридный белок на основе тербий-связывающего пептида(2)
и красного флуоресцентного белка DsRed
гибридный белок на основе тербий-связывающего нептида(2),
линкера с сайтом распознавания каспазы-3 и красного
флуоресцентного белка DsRed
гибридный белок на основе тербий-связывающего пептида(2), линкера с сайтом распознавания каспазы-3 и красного флуоресцентного белка TagRFP К,Х,]Уі’-Тетраметилзтилсндиамин
Time-Resolved Amplification of Cryptate Emission
(коммерциализованная технология гомогенного анализа с временным разрешением)
Time-Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer
(флуоресцентный резонансный перенос энергии с временным разрешением)
молярный коэффициент поглощения

Помимо криптата Eu3+ и аллофикоцианина в методе гомогенного анализа используется криптат Tb3+ (Lumi4-Tb), который в 10-20 раз ярче криптата Еи3+, а в качестве акцепторов - органические флуорофоры, особенно d2 [211]. Коммерческие варианты данной технологии получили названия HTRF® и TRACE® («CisBio International», США).
Органические флуорофоры
Многие , органические флуорофоры, которые обладают интегральным перекрыванием с хелатами ТЬ3+ и Еи3+, используются в качестве акцепторов (табл. 5). Флуоресцирующие красители характеризуются коротким временем жизни, широкими спектрами возбуждения и флуоресценции и малым Стоксовым сдвигом. Они обладают широкой палитрой флуоресценции в УФ-, видимой и ближнеинфракрасной областях. С использованием нескольких спектрально различающихся флуорофоров было показано, что ион ТЬ3+ может являться одновременным донором сразу для двух, трех и четырех акцепторов [212, 213, 214]. Это связано с тем, что ион ТЬ3+ обладает несколькими максимумами флуоресценции [156].
Помимо флуоресцирующих акцепторов используются тушители флуоресценции (BHQ-2, QSY-7, дансил). Такой метод иногда именуется QRET (Quenching Resonanse Energy Transfer) [215], в котором при переносе энергии от донора к акцептору происходит тушение флуоресценции лантанида [216]. Коммерческий вариант использования данных FRET-nap был запатентован под названием TruPoint (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Turku, Finland) [84].
Квантовые точки
Сравнительно новым объектом для конструирования FRET-nap являются квантовые точки. По сравнению с органическими красителями, они обладают в 10-50 раз более высоким по значению коэффициентом экстинкции, в 10-20 раз большей яркостью, в 100-200 раз более высокой фотостабильностью [217]. В работах [218, 219] были получены FRET-пары между комплексами ТЬ3+ и Еи3+ конъюгированных со стрептавидином, и квантовыми точками CdSe/ZnS, конъюгированных с биотином. Большой интеграл перекрывания, высокий коэффициент экстинкции CdSe/ZnS и высокие квантовые выходы комплексов лантанидов (для ТЬ3+ с L-супрамолекулярным комплексом - 0.49, для комплексов Eu3+L и Еи3+-ТВР - 0.20 и 0.24 соответственно) привело к увеличению радиуса Ферстера: 104 А для Tb3+L, 96 А для Eu3+L и 91 А для Еи3+-ТВР. Полученные