Исследование молекулярных механизмов дерегуляции супрессора опухолевого роста PDCD4 в опухолевых клетках

• Автор: Вихрева, Полина Никитична
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 109 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Список использованных сокращений
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
3. ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫДВИГАЕМЫЕ ДЛЯ ЗАЩИТЫ
4. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
4Л. Ген и белок Рбсб
4Л Л. Ген и транскрипт РбсЛ
4Л.2. Структура белка РЛсЛ
4Л.З. Молекулярные механизмы действия РЛсЛ
4.2. Регуляция активности РЛссИ
4.2.1. Регуляция транскрипции РЛсЛ
4.2.2. Регуляция трансляции РбссИ
4.2.3. Регуляция стабильности белка Р<3сс
4.2.4. Внутриклеточная локализация РбсЛ
4.2.5. Регуляция активности РбсЛ
4.3. Характер экспрессии Рс1сс
4.4. Функции Рбсб
4.4.1. РбсЛ4, апоптоз и контроль пролиферации клеток
4.4.2. Влияние Рбсб4 на клеточный цикл
4.5. РЛсб4 и неопластическая трансформация
4.5.1. РбсЛ4 и онкогенез: причинно следственная связь
4.5.2. Прогностическое значение Рбсб
4.5.3. РбсЛ4 и супрессия роста опухолевых клеток
4.5.4. Ангиогенез
4.5.5. РсЫ4 и прогрессия опухоли
4.5.6. РЛсЛ4 и хеморсзистенция
4.5.7. Р(3сс14 как интегральный маркер про-онкогенных изменений
4.6. Заключение
5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
5.1. Реактивы
5.2. Культуры клеток, реагенты и трансфекция
5.3. Вестерн-блот анализ и антитела
5.4. Выделение РНК и ПЦР в реальном времени
5.5. Ферменты
5.5.1. Гидролиз ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции
5.5.2. Обработка фрагментов ДНК фрагментом Кленова
5.5.3. Лигирование фрагментов ДНК
5.6. Получение гшазмидных конструкций
5.6.1. Бактериальные штаммы, среды, реактивы, антибиотики
5.6.2. Приготовление компетентных клеток E. coli
5.6.3. Трансформация клеток E. coli
5.6.4. Секвенирование ДНК
5.6.5. Выделение плазмидной ДНК из клеток E. coli
5.6.6. Электрофорез ДНК в агарозном геле
5.6.7. Очистка фрагментов ДНК
5.6.8. Полимеразная цепная реакция
5.6.9. Клонирование продуктов ПЦР
5.6.10. Получение плазмидных конструкций
5.7. Двойной люциферазный анализ
5.8. Статистическая обработка результатов
6. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
6.1. Анализ экспрессии Pdcd4 в клетках меланомы человека
6.1.1. Уровень белка Pdcd4 в клетках меланомы и нормальных меланоцитах
6.1.2. Роль Akt и MEK/ERK сигнальных путей в супрессии Pdcd4 в клетках
меланомы
6.2. Анализ уровней белка и транскрипта Pdcd4 в клетках линий рака легких
6.3. Роль Akt/mTOR/S6Kl-сигнального пути в супрессии Pdcd4 в опухолевых клетках
рака легких
6.4. Роль протеинкиназы GSK3ß в регуляции экспрессии супрессора опухолевого
роста Pdcd4 в клетках линии рака легких
6.5. Вклад протеолитической деградации белка Pdcd4 в супрессию Pdcd4 в клетках
опухолей легких
6.6. Влияние ингибиторов Akt/mTOR/S6Kl-сигнального пути рапамицина и LY29002 на уровень транскрипта Pdcd
6.7. Вклад микроРНК miR-21 и miR-183 в рапамицин-зависимую супрессию Pdcd4 в опухолевых клетках линии рака легких
6.8. mTOR-зависимая супрессия активности промотора гена Pdcd4 в клетках линии рака легких

6.8.1. Способность ингибитора тТСЖ рапамицина оказывать действие на активность промоторной области гена Рс1с,с
6.8.2. Картирование минимального фрагмента промотора гена Рс1сс14, ответственного за влияние АкСсигнального пути на транскрипционную активность промотора гена Рс1с<
6.8.3. Анализ участков связывания потенциальных транскрипционных факторов с делеционным мутантом промотора гена Р<4сс
6.8.4. Анализ активности репортерного гена под контролем делеционного мутанта минимального фрагмента промотора гена Рс1сй4, опосредующего эффект рапамицина

7. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
6. ВЫВОДЫ
ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
способностью ингибировать рост опухолевых клеток рака молочной железы. Было показано, что агонисты RAR и синтетические ретиноиды, такие как ферентинид, индуцируют апоптоз в злокачественных клетках рака молочной железы, тогда как здоровые клетки не затрагиваются. Для того, чтобы определить, какие гены вовлечены в RAR-зависимое ингибирование роста клеток рака молочной железы, была создана база данных генов, которые потенциально регулируются RAR-агонистами в них. Было показано, что уровень белка Pdcd4 повышается примерно в три раза при обработке клеток рака молочной железы линии T-47D альфа-селективными агонистом RAR Am580 [98]. Пан-агонист RAR и альфа-селективный агонист RAR Am580, но не агонист ретиноидных X рецепторов (RXR), стимулировали экспрессию Pdcd4 в различных исследованных клеточных линиях опухоли молочной железы. RAR-агонисты не индуцировали экспрессию гена Pdcd4 в тех клетках рака молочной железы, рост которых не ингибировался ретиноидами. Так же показано, что антиэстроген (Фулвестрант) и антагонист HER-2/neu (Герцептин) так же индуцировали экспрессию Pdcd4 в клетках линии T-47D, что, вероятно, указывает на центральную роль Pdcd4 в ингибировании пролиферации клеток опухоли молочной железы. Транзиторная сверхэкспрессия Pdcd4 в клетках линий T-47D (ER+, RAR+) и MDA-MB-231 (ER-, RAR-) приводила к апоптотической клеточной гибели, что указывает на роль Pdcd4 как медиатора индукции апоптоза в клетках рака молочной железы. Это первые данные об индукции экспрессии Pdcd4 RAR-агонистами, антиэстрогенами или антагонистами HER2/neu в клетках опухоли молочной железы и его потенциальной роли в процессе апоптоза в этих клетках [98].
Из приведенных выше данных следует, что способность Pdcd4 ингибировать пролиферацию клеток и индуцировать апоптоз не универсальна и почти всегда зависит от типа клеток. Экспериментально показано отсутствие зависимости между уровнем экспрессии Pdcd4 и степенью пролиферации во многих клеточных линиях, а также экспрессией различных белков, ассоциированных с прогрессией клеточного цикла или апоптозом.
4.4.2. Влияние Pdcd4 на клеточный цикл
Pdcd4 участвует в контроле клеточного цикла. Показано, что Pdcd4 через индукцию р21 wafi/Cipi репрессирует транскрипцию CDKl/cdc2 [55]. p2lv'a,l/Clpl блокирует активность CDK2 и CDK4/6 (Рис. 9). Повышенный уровень CDKl/cdc2 характерен при злокачественной трансформации клеток, например легких, молочной железы, кишечника и простаты. Более того, авторы показали прямую зависимость внутриклеточной локализации Pdcd4 и его экспрессии с прогрессией опухоли. И, наконец, было показано,