Разнообразие репертуаров Т-клеточных рецепторов человека и его изменения в ходе старения

• Автор: Путинцева, Екатерина Викторовна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 114 с. : ил.

Оглавление
1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Т-клеточный иммунитет и репертуар ТСЯ

2.1.1. Развитие Т-лимфоцитов в тимусе

2.1.2. Генерация ТСЯ

2.1.3. Участие ар Т-лимфоцитов в адаптивном иммунном ответе

2.1.4. Взаимодействие ТС1? и МНС

2.1.5. Разнообразие репертуаров ТСЯ

2.1.6. Общественные ТС1* клонотипы

2.1.7. Старение Т-клеточного иммунитета человека
2.2. Методы исследования разнообразия индивидуальных репертуаров Т-клеточных рецепторов
2.2.1. Проточная цитометрия
2.2.2. Спектротипирование
2.2.3. Г ибридизация
2.2.4. Секвенирование нуклеотидных последовательностей Т-клеточных рецепторов

2.2.5. Ошибки ПЦР и секвенирования - искусственное разнообразие
3. Цели и задачи
4. Материалы и методы
4.1. Оборудование и расходные материалы
4.2. Реактивы
4.3. Методы
4.3.1. Сбор образцов
4.3.2. Выделение РВМС
4.3.3. Выделение тотальной РНК из клеток
4.3.4. Синтез кДНК
4.3.5. Первый раунд ПЦР-амплификации
4.3.6. Второй раунд ПЦР-амплификации
4.3.7. Секвенирование
4.3.8. Анализ результатов массированного секвенирования
4.3.9. Расчет дивергенции Дженсена-Шеннона между распределениями /р-сегментов
4.3.10. Оценка нижней границы разнообразия репертуара СОРЗ ТС!?р периферической крови

4.3.11. Проточная цитометрия
4.3.12. Н1_А-типирование
5. Результаты и их обсуждение
5.1. Сравнительный анализ репертуаров ТС1?р мам и детей
5.1.1. Распределение частот использования Ур сегментов
5.1.2. Пересечения репертуаров ТС1?р СОРЗ в родственных и неродственных парах мама-ребенок
5.1.3. Одинаковые аминокислотные последовательности СОИЗ чаще сочетаются с одинаковым ур-сегментом в родных парах доноров
5.1.4. Селекция в тимусе снижает среднюю длину^СОРЗ

5.1.5. В поисках зрелых микрохимерных клонов Т-клеток
5.1.6. Оценка пересечения полных индивидуальныхТСРр репертуаров
5.2. Разработка метода нормированного анализа репертуаров ТСЯ с использованием молекулярного баркодирования
5.3.Исследование изменений репертуара ТСРр входе старения человека
5.3.1. Индивидуальное разнообразие ТСРР СОРЗ падает в течение всей жизни человека
5.3.2. Определение нижней границы индивидуального разнообразия ТСРр СОРЗ
5.3.3. Заполнение гомеостатического пространства активированными клонами Т-клеток
5.3.4. Корреляция между разнообразием ТСРр и долей наивных Т-клеток в периферической крови
5.3.5. Образцы периферической крови долгоживущих доноров характеризуются высоким содержанием С04+ наивныхТ-клеток
5.3.6. Возрастные изменения относительной представленности Ур- и 1р-сегментов

5.3.7. Общественные клонотипы и старение
6. Выводы
7. Заключение
8. Список сокращений
9. Список литературы
1.Введение
Эффективность и сбалансированность адаптивной иммунной защиты организма от инфекционных и онкологических заболеваний в значительной степени определяется функциональным и рецепторным разнообразием Т-лимфоцитов [1], [2]. Каждый клон Т-лимфоцитов кодирует уникальный Т-клеточный рецептор (ТС!?), потенциально способный распознать чужеродный антиген в составе молекулы главного комплекса гистосовместимости (МНС), и определяющий специфичность адаптивного иммунного ответа. Высокое индивидуальное разнообразие наивного репертуара ТСК является залогом того, что для новой инфекции или онкологического заболевания найдутся клоны Т-лимфоцитов, специфично распознающие антигены, характерные для данного патогена или патологических клеток. Антиген-специфичные Т-лимфоциты активно размножаются и присутствуют в организме и периферической крови в повышенных концентрациях, причем клетки памяти могут сохраняться в течение десятков лет [3], [4]. Таким образом, индивидуальный репертуар Т-клеточных рецепторов определяет эффективность иммунной защиты, диапазон распознаваемых антигенов, особенности патологических состояний иммунитета и, более того, содержит в себе потенциально читаемую информацию о многих инфекционных, онкологических, и аутоиммунных заболеваниях данного пациента [1], [5].
С развитием современных методов массированного секвенирования репертуаров ТСР [6], [7], иммунофенотипирования Т-клеточных субпопуляций [8], транскриптомики [9], в том числе с единичных клеток [10], статистического анализа репертуаров ТС!? [11], и их потенциальных эпитопов в составе МНС [12], а также методов рентгеноструктурного анализа комплексов ТС(?/пептид/МНС [13] и масс-спектрометрического анализа репертуаров презентируемых пептидов [14], исследования Т-клеточного иммунитета постепенно выходят на более системный уровень [15] [16], приближающий нас к созданию нового поколения методов диагностики и терапии ряда заболеваний, методов вакцинации, а также методов восстановления и поддержания эффективной функции адаптивного иммунитета.
Настоящая работа посвящена анализу индивидуальных репертуаров ТС13р методом глубокого массированного секвенирования. В первой части работы

3. Цели и задачи
Цель настоящей работы заключалась в изучении индивидуального репертуара р-
цепей Т-клеточных рецепторов периферической крови человека и влияния на него
наследственных факторов и старения. Были поставлены следующие задачи:
1) Подготовить библиотеки и методом массированного секвенирования получить данные по индивидуальным репертуарам р-цепей Т-клеточных рецепторов периферической крови для группы матерей и их детей;
2) Провести сравнительный анализ состава и структуры репертуаров р-цепей Т-клеточных рецепторов родственных и неродственных пар мама-ребенок;
3) Разработать метод на основе молекулярного баркодирования, позволяющий проводить корректное сравнение разнообразия репертуаров СРЯЗ участков библиотек генов ТС!?, полученных от различных доноров, в условиях разного количества клеток на старте, разного качества РНК, и разной глубины массированного секвенирования;
4) Подготовить молекулярно-баркодированные библиотеки и методом массированного секвенирования получить данные по индивидуальным репертуарам р-цепей Т-клеточных рецепторов периферической крови для когорты системно здоровых доноров разных возрастов;
5) Провести сравнительный анализ нормированного разнообразия репертуаров р-цепей Т-клеточных рецепторов периферической крови для доноров различного возраста.