Изучение экспрессии и взаимодействий белка Stellate в семенниках Drosophila melanogaster

• Автор: Егорова, Ксения Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 102 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Список сокращений
1. Общая характеристика работы
1.1 Актуальность проблемы
1.2 Задачи исследования
1.3 Научная новизна результатов исследования
1.4 Практическая ценность
1.5 Апробация работы
2 Обзор литературы
2.1 Экспрессия тандемных кластеров генов Stellate в семенниках Drosophila melanogaster
2.1.1 Система crystal-Stellate
2.1.2 Гены Stellate являются мишенью piPHK-сайленсинга
2.1.3 Происхождение генетической системы crystal-Stellate
2.1.4. Изучение особенностей белка Stellate
2.2 Протеинкиназа СК2
2.2.1 Роль СК2 в клетках различных организмов
2.2.2 Структурно-функциональные характеристики СК2
2.2.3 Мишени СК2
2.2.4 CK2ß: внутривидовые особенности
2.2.5 Мишени СК2 у D. melanogaster
2.3 Метилирование негистоновых белков по остаткам лизина как способ регуляции их стабильности и функциональности
2.3.1 Метилирование гистонов и концепция гистонового кода
2.3.2 Метилирование транскрипционных факторов и других ядерных белков
2.3.3 Метилирование белков трансляционного аппарата
2.3.4 Белки, узнающие метилированные остатки лизинов («метизтизин-ридеры»)
2.3.5 Итоги и дальнейшие перспективы изучения метилированных белков
3. Материалы и методы
3.1 Линии Drosophila melanogaster, использованные в работе
3.1.1 Схема скрещивания для получения мух с делецией локуса crystal, гетерозиготных по инсерции в ген гистонметилтрансферазы Su(Var)

3.2 Экспрессия и очистка рекомбинантного белка Stellate
3.3 Получение антител к белку Stellate
3.4 Иммунофлуоресцентное окрашивание и конфокальная микроскопия
3.5 Электрофорез в денатурирующих условиях в ДСН-ПААГ и Вестерн-блот-анализ
3.5.1 Приготовление модифицированного полиакриламидного геля с измененной процентностыо сшивки
3.5.2 Окрашивание ПА/1Г «Кумасси»
3.5.3 Окрашивание ПААТ серебром
3.6 Антитела
3.7 Субклеточное фракционирование
3.8 Фракционирование в градиенте сахарозы
3.9 Субъядерное фракционирование
3.10 Иммунопреципитация
3.10.1 Ковалентная пришивка антител к npomeuH-G-сефарозе
3.11 Аналитическая очистка белка Stellate и идентификация сайта метилирования
3.12 Химическая сшивка белков in nucleo
3.13 Фосфатазный анализ
3.14 Иммуноферментнын сорбционный анализ (ELISA)
4. Результаты
4.1 Получение антител к белку Stellate
4.2 Субклеточная локализация белка Stellate
4.3 Поиск партнеров белка Stellate
4.4 Stellate подвергается метилированию по остатку лизина
4.5 Разделение белков Stellate на фракции, кодируемые эухроматиновыми и гетерохроматиновыми повторами Stellate
5. Обсуяаденне
5.1 Субклеточная локализация белка Stellate
5.2 Взаимодействие Stellate с СК2а
5.3 Триме гилирование Stellate
5.4 Модель патогенеза при сверхэкспрессии Stellate
6. Выводы
7. Литература

Благодарности

2008). Tat действует как активатор инициации и элонгации транскрипции с единственного промотора HIV-1, встроенного в геном в области длинного терминального повтора. Показано, что Tat взаимодействует со специфическим PIIK-энхансерным элементом TAR в 5’-области вирусного транскрипта, привлекая к промотору факторы транскрипционного аппарата клетки-хозяина (Brady and Kashanchi, 2005). Tat подвергается множеству посттрансляционных модификаций, осуществляемых белками хозяина: фосфорилированию, ацетилированию,
убиквитинилнрованию и метилированию по остаткам лизина и аргинина. Положительно заряженный домен Tat (49-57 а. о.), ответственный за связывание с TAR, подвергается ацетилированию, что необходимо для Tat-опосредованной трансактивации. Метилирование остатков лизина К50 и К51, осуществляемое ГЛМТ SETDB1, конкурирует с их ацетилированием и репрессирует транскрипцию вирусной мРНК (Van Duyne et al., 2008). Ранее было показано, иго метилирование соседних остатков аргинина R52 и R53, осуществляемое PRMT 6, также приводит к ослаблению взаимодействия Tat с TAR и к подавлению вирусной транскрипции (Xie et al., 2007). Дальнейшие исследования помогут выяснить, является ли метилирование Tat проявлением внутриклеточной иммунной защиты для ограничения вирусной репликации.
2.3.3 Метилирование белков трансляционного аппарата
Различные компоненты трансляционного аппарата подвергаются посттрансляционным модификациям, в том числе и метилированию. Метилирование рибосомальных белков происходит преимущественно по остаткам аргинина и лизина и обнаружено у прокариот, архей и эукариот. Более того, паттерн метилирования схож у различных эубактерий, а также частично перекрывается с паттерном метилирования архей и эукариот, хотя наблюдаются и значительные различия, например, большая частота встречаемости метилирования остатков аргинина у высших эукариот (Polevoda and Sherman, 2007). Так, метилирование по остаткам лизина обнаружено в элонгационном факторе Tu (EF-Tu) бактерий (Van Noort et al., 1986) и его эгомологе EF-la эукариот (Polevoda and Sherman, 2007; Cavallius et al., 1993; Dever et al., 1989; Van Hemert et al., 1984). Основные данные по метилированию рибосомальных белков и трансляционных факторов представлены в Таблице 2.