Разработка прототипа ДНК-вакцины для иммунотерапии гепатоцеллюлярной карциномы

• Автор: Морозов, Алексей Владимирович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 136 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ И ЦЕЛЬ РАБОТЫ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1Л Первичные злокачественные опухоли печени

1.1Л Классификация гепатом

1Л .2 Этиологические факторы

1Л. 3 Диагностика ГЦК

1Л .4 Современные подходы, применяемые при лечении печени,

пораженной ГЦК

1.2 Альфа-фетопротеин
1.2Л. История открытия АФП
1.2.2. Регуляция синтеза АФП
1.2.3. Генетические варианты АФП
1.2.4. Структура и функции АФП
1.2.5. Мембранные рецепторы
1.2.6. Возможные объяснения экспрессии АФП клетками опухоли

1.2.7. Клеточный и гуморальный иммунный ответ к АФП у
больных ГЦК и здоровых доноров
1.3 ДНК-вакцины
1.3.1 Введение
1.3.2 История
1.3.3 Механизм развития иммунного ответа при ДНК-вакцинации
1.3.3.1 26Б протеасома
1.3.3.2 Образование антигенных пемтидов
1.3.4 Факторы, влияющие на индукцию иммунного ответа
1.3.5 Стратегии усиления иммунного ответа
1.3.6 Клинический опыт использования ДНК-вакцин
1.3.7 ДНК-вакцины, кодирующие АФП
1.4 Орнитин декарбоксилаза
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Оборудование и реактивы
2.1.1 Оборудование
2.1.2 Реактивы
2.1.3 Ферменты
2.1.4 Питательные среды
2.1.5 Буферы
2.1.6 Антитела
2.2 Животные
2.3 Клеточные линии и условия их культивирования
2.3.1 Клеточные линии
2.3.2 Условия культивирования клеток
2.4 Антигены
2.5 Векторы
2.5.1 Конструирование вектора рАБР
2.5.2 Конструирование вектора рАРР(ЮС51§па1
2.5.3 Создание плазмид рДАРР и рДАРРСЮСз1§па1
2.5.4 Получение векторов рДАРРСАв и рДАБРЬСАв
2.5.5 Использованные праймеры
2.5.6 Получение компетентных клеток
2.6 Трансфекция и Вестерн блоттинг
2.6.1 Трансфекция
2.6.2 Лизирование клеток
2.6.3 Электрофорез в полиакриламидном геле
2.6.3.1 Электорфорез в денатурирующих условиях
2.6.3.2 Электрофорез в не денатурирующих условиях (Нативный ПААТ)
2.6.4 Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану
2.6.5 Вестерн блоттинг
2.7 Анализ культуральной жидкости трансфицированных клеток
2.8 Изучение протеасомной деградации белков и их стабильности
2.9 Иммунофлюоресценция

2.9.1 Анализ скорости деградации АФП с помощью иммунофлюоресценции
2.9.2 Двойная иммунофлюоресценция
2.10 Получение модели перевиваемой гепатомы
2.11 Иммуногистохимия
2.12 Получение новых клеточных линий
2.13 Иммунизация мышей ДНК-вакцинами
2.14 Компьютерные программы
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1 Эксперименты in vitro
3.1.1 Дизайн и создание ДНК-вакцин
3.1.2 Анализ экспрессии рекомбинантных белков в трансфицированных клетках
3.1.3 Анализ секреции рекомбинантных белков из трансфицированных клеток
3.1.4 Анализ олигомеризации рекомбинантных белков в клетках
3.1.5 Анализ периода полураспада рекомбинантных белков в клетках
3.1.6 Анализ эффективности протеасомной деградации рекомбинантных белков
3.1.7 Локализация рекомбинантных белков в трансфицированных клетках
3.1.8 AFPODCsignal накапливается в Эндоплазматическом Ретикулуме (ЭПР)
3.1.9 Создание векторов pAAFPCAG и pAAFPLCAG
3.1.10 Анализ вероятных изменений структуры С-концевых областей модифицированых белков pAAFPCAG и pAAFPLCAG
3.1.11 Введение ключевых аминокислот дегрона ОДК на С-конец AAFP не влияет на скорость его деградации
3.2 Эксперименты in vivo
3.2.1 Создание модели перевиваемой гепатомы у мышей линии C57BL/6

Внутриклеточный антиген
Внешний АПК антиген
Ж Эндосома
Протеї Б
Лизосома
гкги
Рис. 6. Процессирование и презентация «внутреннего» и «внешнего» антигена в комплексе с молекулами ГКГ I и II классов. Слева: вирусный белок, синтезированный внутри АПК (а), деградирует внутри протеасомы (б), после чего его пептиды связываются с белком ТАР и внутри ЭПР соединяются с ГКГ I класса (в). ГКГ, соединенный с вирусным пептидом, через аппарат Гольджи (г) транспортируется внутри везикул на поверхность клеточной мембраны (д), где происходит презентация антигена ЦТЛ. Справа: внешний антиген эндоцитируется клеткой (А) и деградирует внутри лизосомы (Б). Молекулы ГКГ II класса синтезируются клеткой и импортируются в ЭПР (В), далее они транспортируются внутрь аппарата Гольджи (Г), после чего происходит слияние везикулы, содержащей ГКГ с лизосомой, содержащей антигенные пептиды (Д). После чего молекула ГКГ II класса, соединенная с одним из пептидов, транспортируется на поверхность мембраны клетки, где также происходит презентация антигена Тх1 или Тх2 клеткам [184][61]. Кросс-презентация антигена (Ж). Внешний антиген, после эндоцитоза, оказывается в цитоплазме и процессируется как внутренний.
Так как центральное место в деградации внутреннего антигена занимает протеасома, представляется интересным описать ее несколько подробнее.