Исследование особенностей анаэробного дыхания электрогенной бактерии Shewanella oneidensis MR-1 и структуры уридинфосфорилазы из нее

• Автор: Мордкович, Надежда Николаевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 182 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений

1.Введени е

2. Обзор литературы

2. Особенности метаболизма, анаэробного дыхания и перспективы практического применения бактерии БкемнтеПа опе/Лепьчх МЛ-

2.1. Общие сведения о 5. опе1с1ет15 МЛ-

2.2. Метаболизм углерода у 5. опе1с1ет1з МЛ-

2.2.1. Особенности гликолиза у б'. опе1с1ет18 МЛ-

2.2.2. Утилизация Т4-ацетилглюкозамина

2.2.3. Утилизация лактата и пирувата у У oneidensis МЛ-

2.3. Особенности анаэробного дыхания б. опе/с/тш МЛ-
2.3.1. Первичные акцепторы электронов внешней и внутренней стороны ЦМ
2.3.1.1. Тетрагемовый цитохром СутА
2.3.2. Периплазматические редуктазы
2.3.2.1. Фумаратредуктаза БссА
2.3.2.2. Периплазматическая нитратредуктаза ЫарАВ
2.3.2.3. Периплазматическая нитритредуктаза №ТА
2.3.3. Периплазматические переносчики электронов
2.3.3.1. Тетрагемовый цитохром 8ТС
2.3.3.2. Десятигемовый периплазматический цитохром МЛА
2.3.3.3. Десятигемовый периплазматический цитохром ОгшЕ
2.3.4. Цитохромные комплексы, ассоциированные с внешней клеточной мембраной
2.З.4.1. МЕВС-ОтсА

2.3.4.2. DmsAB
2.3.5. СушА-независимые ветви ЭТЦ
2.3.5.1. Восстановление ТМАО
2.3.5.2. Восстановление тиосульфата и сульфита
2.3.6. Механизмы передачи электронов при анаэробном дыхании
2.3.6.1. Прямая передача электрона
2.3.6.2. Перенос электронов с участием молекул-переносчиков
2.5. Использование S. oneidensis MR-1 в МТЭ
2.6. Применение S. oneidensis MR-1 в качестве штамма-реципиента для гетерологичной и гомологичной экспрессии
3. Материалы и методы
3.1. Материалы
3.2. Методы
3.3. Базы данных и программы
4. Результаты и обсуждение
4.1. Конструирование рекомбинантного штамма S. oneidensis MR-1, характеризующегося повышенной редуцирующей активностью
4.1.1. Клонирование и исследование гетерологичной экспрессии гена NAD-зависимой формиатдегидрогеназы из метилотрофной бактерии Moraxella sp.
в клетках S. oneidensis MR-
4.1.2. Исследование изменения интенсивности анаэробного дыхания при гетерологичной экспрессии ЫАЭ+-зависимой формиатдегидрогеназы в клетках S. oneidensis MR-
4.1.3. Культивирование штамма-трансформанта S. oneidensis MR-1/pERFDH в МТЭ

4.2. Исследование особенностей регуляции экспрессии под контролем промотер-операторной области гена г<ф 5. опеісіепзіз МЛ-
4.3. Изучение свойств и структурных особенностей уридинфосфорилазы из электрогенной бактерии 5. опеісіетів МЛ-
4.3.1. Клонирование гена уридинфосфорилазы из 5. опеісіетіз МЛ-1, гомологичная и гетерологичная экспрессия гена мф
4.3.2. Структурно-функциональная характеристика уридинфосфорилазы
из б", опеісіепзіз МЛ-
4.3.2.1. Выделение и очистка рекомбинантной Б1ЮР
4.3.2.2. Масс-спектрометрический (МАІЛЗІ) анализ выделенного белка БШР
4.3.2.3. Анализ четвертичной структуры БІЮР (гель-фильтрация)
4.3.2.4. Определение температурного оптимума БІГОР
4.3.2.5. Определение рН-оптимума и изоэлектрической точки 81ЮР
4.3.2.7.Термическая денатурация уридинфосфорилазы из 5. опеісіетіь МЛ-
(БШР)
4.3.2.8. Исследование структуры 81ЮР методом РСА
4.4. Получение и структурно-функциональная характеристика мутантной формы уридинфосфорилазы из 5. опеісіетіз МЛ-1 (С2128)
4.4.1. Конструирование мутантной формы С2128, выделение и очистка белка.
4.4.2. Масс-спектрометрический (МАИИ1) анализ выделенного мутантного белка 81ЮР
4.4.3. Анализ четвертичной структуры мутантной формы 81ГОР (гель-фильтрация)
4.4.4. Исследование температурного и рН-оптимумов мутантной формы фермента (С212Б) и его изоэлектрической точки

образом, экспериментально было показано, что возможен прямой перенос электрона между СутА и нитратредуктазой №рА [80]. На рисунке 5 представлена схема ЭТЦ с использованием в качестве конечного акцептора электронов нитрата и нитрита.
Рисунок 5. Схема организации ЭТЦ 5. опе1с1епх1$ МК-1 в анаэробных условиях в присутствии нитрата и нитрита. ОМ - внешняя мембрана, 1М -цитоплазматическая мембрана, МО - менахиноны, стрелками показан поток электронов в ЭТЦ. Рисунок из работы [80].
По-видимому, физиологическая роль №рВ может заключаться в регуляции направленной передачи электрона от СутА на №рА для более эффективного использования нитрата, как акцептора электронов. При значительном уменьшении концентрации нитрата, происходит «переключение» в передаче электронов с СутА на №£А (нитритредуктаза), что приводит к восстановлению нитрита до аммония. В отсутствие белка ЫарВ электроны с цитохрома СутА в равной степени передаются как на ЫарА, так и на №£А [80].
2.З.2.З. Периплазматическая нитритредуктаза 1гГА
Как было установлено экспериментально, бактерия Б. опе1с1ет18 М11-1 способна использовать в качестве акцептора электронов также ион нитрита [144].